虚拟结构光照明双光子荧光显微成像

邵永红，郑晓敏，汪 磊，吴文帅，周 洁，陈嘉杰

深圳大学物理与光电工程学院，光电器件与系统教育部/广东省重点实验室，广东深圳 518060

荧光显微成像已广泛用于生物医学研究，然而由于光学衍射系统的限制，可达到的最小分辨距离约为200 nm．为提高光学系统分辨率，出现了一系列新型超分辨技术，如受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED)荧光显微技术、随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)和结构光照明显微成像技术(structured illumination microscopy, SIM)[1-5]．STED技术将系统分辨率大幅提高至远高于衍射极限分辨率水平(几十nm或更高)，但所需的高功率受激辐射耗尽激光对生物样品(特别是活细胞)损伤较大，因此，不适于活细胞动态成像．STED技术必须使用特殊STED染料，这限制了样品的范围．STORM技术的横向和轴向分辨率分别可达到高于20 nm和50 nm的水平，但重构一幅超分辨图像需要采集平均数万张原始图像，限制了成像速度．STORM技术还需要具有开关效应的荧光探针，对染料要求较高，限制了其适用范围．SIM技术可将成像分辨率提高近2倍，且不需要特殊染料和高功率激光，光学系统相对简单，便于与其他系统兼容，成像速度快，有利于活细胞成像[6-7]．

在结构光超分辨成像技术中，采用光栅投影或双光束干涉形式，在样品中产生强度正弦调制的结构光图案，利用结构光与样本频谱的卷积作用，将不可探测的高频信息转化为可探测的低频信息，通过相移算法重构超分辨图像．为了解这些已被混频的高频信息，需获取不同相位下结构光照明产生的荧光图案，如在线性结构光照明超分辨成像中，相邻两幅结构光图案的相位差为2π/3，每个方向需要采集3幅荧光图像，3个方向共需采集9幅荧光图像，最终通过算法重构出超分辨图像，将分辨率提高2倍．然而，在这种结构光调制方式下，为减小伪影，获取高质量的超分辨图像，需要精确控制结构光图案的相移，大的相移误差会导致解频错误而无法实现超分辨成像[8-10]．为了解决结构光相移难的问题，研究提出虚拟结构光技术．不同于传统结构光成像技术利用硬件进行结构光调制，虚拟结构光可以通过后期软件编程对荧光衍射图像进行结构光调制，直接避免了相移误差，同样可以将分辨率提高2倍，并实现活体成像[11-13]．在视网膜形态学研究中，由于眼球运动不可避免，导致很难获得这类动态物体的高分辨率图像．为满足眼球运动的快速成像要求，研究通过将虚拟结构光与行扫描成像系统结合以提高成像速度，获得高分辨率的视网膜活体成像[14-16]．

对于具有一定厚度的易散射样品，单光子过程的激发深度被限制在样品表面以下几十μm；随着成像深度的增加，信噪比下降导致分辨率的显著下降，限制了虚拟结构光技术的超分辨能力．多光子效应荧光成像具有穿透深度大、光损伤小和光漂白小等优势，已成为生物医学研究的重要手段[17-18]．然而，由于双光子过程的非线性响应，导致激发点扩展函数与发射点扩展函数不能近似相等，因此，线性结构光公式不能直接用于双光子虚拟结构光．

为同时提高成像深度与系统分辨率，本研究将多光子效应与虚拟结构光技术相结合，提出虚拟结构光照明双光子荧光超分辨成像方法，推导成像理论公式，模拟成像实验．结果证明，该方法能够将分辨率提高1.95倍，可用于高散射厚样本的超分辨成像．

1 虚拟结构光照明双光子荧光成像原理

1.1 光学成像系统

虚拟结构光照明双光子荧光成像系统采用点扫描激发与面探测相结合光路，如图1．飞秒激光器产生近红外飞秒脉冲激光，为避免高功率激光反射回激光谐振器干扰锁模，需在激光器后放置光隔离器．激光经x-y轴振镜扫描后到达管镜，激发滤光片用于过滤激发光以外的干扰光，再以高数值孔径物镜聚焦至样品，通过双光子过程激发样品产生荧光，荧光经由物镜后进入二向色镜反射至发射滤光片，最后被面探测器采集．由于双光子效应，仅焦点处的样本可被激发出荧光，从而减少了焦平面外的背景信号，提高了光学切片能力．

图1 虚拟结构光照明双光子荧光成像系统光路示意图Fig.1 The scheme of two-photon virtual structured illumination microscopy

1.2 虚拟结构光照明双光子荧光成像理论

通过点扫描将样本逐点激发．由于存在物镜衍射，每个激发点的激发光通过物镜后，在焦面处被衍射成为一个艾里斑，因此，除物镜焦点处的样本被激发产生荧光外，焦点附近的样本也被激发．在双光子效应中，荧光强度与激发光强度的平方成正比，因此，产生的荧光光强与激发点扩散函数的平方成正比．每个激发点激发出的荧光通过物镜被面探测器(scientific complementary metal-oxide semiconductor, sCMOS)成像记录，探测器不仅记录到焦点处的样本信息，也记录到焦点外艾里斑内的样本信息，这为后期的超分辨提供可能．通过逐点扫描和逐幅记录，可以获得一系列点样本的衍射斑图．以上成像过程可表示为

imag(r,rs,rd)(n)=

(1)

其中， imag(r,rs,rd)(n)表示采集到的第n个衍射斑图像；r为扫描位置坐标；rs为样本面坐标；rd为成像面坐标；hex(r)和hem(r)分别表示激发点扩散函数和发射点扩散函数，均由光学系统决定，且与光波长有关；s(r)表示样本荧光团分布．

为讨论方便，以下以扫描点坐标的横坐标x分量rx、rsx及rdx代替r、rs及rd进行推导. 将每张衍射斑图都乘以相同的正弦条纹进行调制，然后将所有像素相加后赋值给焦点位置，得到样本的总衍射图像，可表示为

(2)

(3)

其中，i(rx)为结构光调制混频后的总衍射图像；p(rdx)为调制函数；k0为空间频率；φ为相位．

将p(rdx)代入i(rx)得

(4)

其中， *是卷积运算．在传统结构光成像中，调制函数的空间频率受系统激发点扩散函数的限制，使结构光超分辨技术最多可使分辨率提高2倍．由式(4)可见，在双光子虚拟结构光中，由于积分运算，激发点扩散函数与发射点扩散函数位置颠倒，此时限制调制函数空间频率的是发射点扩散函数．在双光子效应中，激发点扩散函数的平方与发射点扩散函数差异不大，可忽略其差异，因此，最终成像效果与传统结构光成像技术相同．

以下对该混频图像进行解频并重建超分辨图像．对式(4)进行傅里叶变换得

I(k)={[P(k)OTFem(k) ]*S(k) }×

[OTFex(k)*OTFex(k)]

(5)

(6)

其中，k为频域坐标；P(k)、S(k)、 OTFex(k)和OTFem(k)分别为p(rx)、s(rx)、hex(rx)和hem(rx)的傅里叶变换．将式(6)代入式(5)得

[OTFex(k)*OTFex(k)]

(7)

为了能够解出S(k)[OTFex(k)*OTFex(k)]、OTFem(k0)S(k-k0)[OTFex(k)*OTFex(k)]和OTFem(-k0)S(k+k0)[OTFex(k)*OTFex(k)]分量，需要建立3个相位方程，即

(8)

对应的解频公式为

(9)

2 实 验

2.1 Lena图像模拟实验

为了定性验证双光子虚拟结构光超分辨成像效果，对Lena图像进行模拟成像．设置单位像素长度为40 nm，激发光波长为800 nm，样品发射光波长为560 nm，数值孔径(numerical aperture, NA)为1.4，则由瑞利判据可得到系统的最小分辨距离为

(10)

图2为传统双光子与虚拟结构光照明双光子的模拟成像Lena图片．对图2(a)的无衍射样本图像以双光子点扫描形式进行模拟成像，可得如图2(b)的传统双光子衍射图像；再对所得双光子衍射斑图像集按照虚拟结构光照明双光子荧光超分辨成像方法进行混频调制，可以得到混频图像．最后通过对该混频图像解频并重建，得到更高分辨率的超分辨图像，如图2(c)．对比图2矩形框内的高频条纹图像可见，图2(c)可以分辨这些条纹，而图2(b)不能分辨，证明虚拟结构光照明双光子荧光成像具有超分辨的成像能力．

图2 传统双光子与虚拟结构光照明双光子模拟成像Lena图片Fig.2 Simulated imaging of Lena picture for conventional two-photon microscopy and two-photon virtual SIM

2.2 荧光珠实验

为定量分析虚拟结构光照明双光子荧光超分辨成像能力，通过模拟实验对100 nm荧光珠进行传统双光子与虚拟结构光照明双光子成像对比研究．成像条件与Lena图像实验相同．模拟得到的传统双光子图像如图3(a)．可见，无法分辨图3(a)中实线段位置的荧光珠．以点扫描形式对样本进行虚拟结构光照明双光子荧光成像，即激发光斑每移动1个位置，记录1幅艾里斑图像，得到一系列衍射斑图；根据虚拟结构光照明双光子荧光成像方法，对衍射斑图逐幅乘以相同的正弦条纹并积分进行混频调制；最后通过结构光重建算法恢复出超分辨图像，如图3(b)．可见，虚拟结构光照明双光子荧光成像能够将图3(a)中实线段位置的荧光珠分开．为了定量描述分辨率能力，分别选择了1个和3个相近的荧光珠，沿图3(a)或图3(b)中虚线段或实线段位置获取强度分布，如图3(c)和图3(d)．由图3(c)可见，单个荧光珠的半高宽分别为235 nm和120 nm，虚拟结构光照明双光子荧光成像将分辨率提高了1.95倍；为展示频谱展宽效果，绘制相应频谱分布图，如图3(e)和图3(f)，虚拟结构光照明双光子荧光成像实现了频谱均匀拓宽．

图3 传统双光子与虚拟结构光照明双光子模拟成像100 nm荧光珠Fig.3 Comparison of resolution capability between conventional two-photon microscopy and two-photon virtual SIM by simulated imaging of 100 nm fluorescent beads

结 语

针对厚组织的高分辨率成像需求，提出虚拟结构光照明双光子荧光成像技术，设计该方法的光学系统结构，推导成像原理，建立虚拟结构光照明双光子荧光超分辨图像的重构算法，并通过模拟验证该方法有效．结果表明，虚拟结构光照明双光子荧光成像能够将传统双光子成像分辨率提高1.95倍，对厚样本的高分辨率成像具有重要意义．

尽管虚拟结构光照明双光子荧光成像可以避免精确控制相移的问题，但存在采集幅数多，成像速度慢的缺点．多点并行技术已经成为提高成像速度的有效手段，因此，将来结合线扫描或多焦点扫描方案，可以提高成像速度，并降低数据量，有利于虚拟结构光照明双光子荧光超分辨图像重构算法的数据处理．在生物成像应用方面，虚拟结构光照明双光子荧光成像具有成像深度大的优势，适于厚度较大生物样品成像研究．通过结合线扫描或多焦点扫描技术，有望实现活细胞动态超分辨成像．虚拟结构光照明双光子荧光成像技术在生物医学研究方面具有良好应用前景．