宫颈癌中EB病毒感染与 P16蛋白表达的相关性

李纳

摘要：目的：分析EB病毒感染与宫颈癌的关系，探寻P16在宫颈癌中的表达情况，初步揭示P16和EB病毒感染的相关关系，以及与患者临床病理学特征的关系。方法：免疫组化法检测100例宫颈癌患者石蜡标本和30例正常的宫颈标本中P16表达水平，用原位杂交CISH显色技术，检测两组标本的EB病毒的阳性率，进而分析宫颈癌中EB病毒的感染率与P16表达的相互关系。结果：EB病毒阳性表达率在宫颈癌为37 %，正常宫颈组中未检测到EB病毒，两组间的差异有显著性（P < 0.05） 。P16在两组的阳性表达率分别为87 %和13.3 %，两组间的差异有显著性（P < 0.05） ，低分化癌中P16+EBV阳性率为41.67 %，与中高分化的宫颈癌相比较，差异有显著性（P ﹤ 0.05） 。结论：宫颈癌发生发展过程中，EB病毒的感染影响了P16的异常表达，二者可能共同参与宫颈癌的恶性程度病变。但可能没有直接参与宫颈癌细胞的浸润和扩散。

关键词：宫颈癌;P16蛋白;EB病毒;原位杂交CISH;免疫组化

宫颈癌是女性生殖系统恶性肿瘤之一，近年来，宫颈癌的发病率逐年升高，且呈现年轻化趋势[1]。在炎性细胞的持续刺激下，宫颈正常细胞周期调节逐渐失控，抑癌基因过度表达，细胞凋亡紊乱，出现不断的恶性增殖、分化、侵袭和转移 [2]。本研究目的是，在宫颈癌发生发展过程中，EB病毒的感染是否影响了P16蛋白的表达，从而引起细胞周期调节失控，共同参与宫颈癌的恶化进展，为阐明二者在宫颈癌发生、发展中的意义及相关关系提供更充分的科学依据。现报道如下：

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取广东省中山市小榄人民医院2017～2021年收治宫颈癌手术患者的癌组织石蜡标本100例为一组，正常宫颈标本30例为一组。年龄30～66岁，平均年龄为（45. 28±7. 85） 岁。纳入标准：经组织病理学检查确诊为慢性宫颈炎且未见宫颈病变。两组年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05） ，具有可比性。本次研究是利用以往临床诊疗中的石蜡标本采集获得，申请了免除受试者知情同意，已获得医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 免疫组织化学和EB原位杂交

所有蜡块均经10 %福尔马林固定，常规取材，石蜡包埋，切4 μm厚度，与阳性片同置粘附载玻片，60度烘烤1.5小时。用Dako Envision FLEX PTlink48预处理和AutostainerLink48自动染色系统（修复液和免疫显色试剂均购自广州宝迪科技有限公司） ，按说明书检测。EBER杂交试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司） ，按说明书检测。

1.3 评分标准

P16蛋白的表达以细胞核呈清晰的棕色或细胞核、细胞浆同时呈棕色为阳性，每例随机数10个高倍视野，平均每100个瘤细胞中阳性细胞数在25以上;EB病毒镜下以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每例随机数10个高倍视野，平均每100个瘤细胞中阳性细胞数在10以上。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件分析正常宫颈、宫颈癌P16和EB病毒阳性率，析因分析EB病毒感染与P16在宫颈癌的发生发展中是否存在协同作用，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16蛋白检测率

宫颈癌P16的阳性率87 %（87/100） ，高于正常13.3 %（4/30） ，差异有统计学意义（χ2 = 96.053，P ﹤ 0.01） 。Ⅰ 期和Ⅱ期P16阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05） ;低分化、有淋巴结转移宫颈癌P16阳性率均高于中高分化、无淋巴结转移的宫颈癌患者，差异均有统计学意义（P ﹤ 0.05） ，见表1。

2.2 EB病毒检测率

正常宫颈未检测到EB病毒，宫颈癌中EB病毒阳性率37 %（37/100） ，差异有显著性（χ2 = 152.837，P ﹤ 0.01） 。淋巴结转移及宫颈癌分期患者中EB病毒的阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05） ;低分化癌中的阳性率高于中高分化的宫颈癌患者，差异有统计学意义（P ﹤ 0.05） ，见表1。

2.3 P16+EBV阳性检测率

宫颈癌Ⅰ期P16+EBV阳性率为21.73 %，与Ⅱ期比较差异无显著性（P > 0.05） ;淋巴结有转移者阳性率33.33 %，与无转移比较，差异无显著性（P ﹤ 0.05） ;低分化癌P16+EBV阳性率为41.67 %，与中高分化相比，差异有显著性（P ﹤ 0.05） ，见表2。

3 讨论

十年来我国宫颈癌患病率由15.1/10万升到 43.3/10万，而2019年广东省女性宫颈癌为49.8/10万，远高于全国水平[3]。宫颈癌病因复杂，与年龄、受教育程度、自我保护意识、卫生条件、性生活史、生殖道感染、生活习惯以及情绪压力等因素均相关[4]。P16位于人类染色体9p21，是周期蛋白依赖性激酶抑制因子，通过抑制细胞周期依赖激酶4和6，促进视网膜母细胞瘤蛋白与转录因子E2F连接，抑制恶变细胞增殖和分化[5～6]。隨着宫颈细胞恶变，P16常出现过表达[7]。本次实验宫颈癌P16阳性为87 %（87/100） ，明显高于正常宫颈13.3 %（4/30） ，恶性越高且转移的患者P16表达程度越高，提示P16参与了宫颈癌的进展与转移，与以往研究相符。EB病毒是一种嗜人类淋巴细胞的γ-1型的疱疹病毒，可以感染T和B或NK细胞，与众多肿瘤的发生有关[8]。EB病毒可辅助诱导宫颈癌发生，在CIN中感染较为常见，特别是CIN3和宫颈癌[9]。SLAWA 等研究表明感染EB病毒可能参与HPV16基因整合并且有助于宫颈癌的发展[10]。有研究肺鳞癌EBER（+） 组，EB病毒感染通过改变P16导致肺上皮细胞的恶性转化[11]。EB病毒感染的胃癌患者，P16基因启动子区域CpG岛高甲基化，导致其表达缺失[12]。P16作为 HPV 病毒感染比较特异的作用位点研究已较明确[13]，但宫颈癌中 EB 和P16的关系尚不明确。本次实验发现，正常宫颈没有EB感染，宫颈癌EB阳性率为37 %（37/100） ，提示分化程度越低，感染率越高。低分化癌P16+EBV阳性率与中高分化相比，差异有显著性，分析EB病毒受体并非B细胞表面独有，可存在宫颈上皮细胞中，EB感染可能干扰了P16基因状态，影响P16正常表达，二者共同促进病变及癌细胞的发生发展。但宫颈癌分期以及癌转移中，P16与EB感染阳性之间的差异无统计学意义，表明EB病毒感染没有直接参与宫颈癌浸润和转移，可能与其他因子共同作用，协同促进宫颈癌浸润与扩散。

综上所述，EB病毒的感染可能参与干扰了P16的基因正常状态，二者共同促进了宫颈细胞恶性病变及发生发展，但需要其他因子的协同作用，与P16共同参与宫颈癌细胞的浸润扩散和远处转移。

参考文献

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