宫腔镜术治疗宫腔黏连后患者miR-543、miR-135a表达与再复发关系

陈国英 邱 萍 史淑兰

江苏省靖江市人民医院(214500)

宫腔黏连可导致宫腔内壁部分或全部黏连闭锁，导致患者月经异常、周期性腹痛、不孕、流产等[1]。宫腔镜是诊断和治疗宫腔黏连的重要手段，但宫腔镜治疗后再复发率较高[2]。探究再复发影响因子对改善宫腔黏连术预后有重要意义。子宫内膜纤维化、炎症反应等是宫腔黏连发生的主要机制[1]。Zhu等[3]研究发现，瘢痕妊娠患者成纤维细胞中miR-543表达上调，miR-543可通过调控相关靶基因抑制纤维化进展。miR-135a在心肌纤维化大鼠中表达明显降低，过表达可抑制心内膜心肌纤维化[4]。宫腔黏连患者子宫内膜组织中miR-543、miR-135a存在异常表达，可能与黏连严重程度有关[5]。本研究通过检测行宫腔镜术治疗的宫腔黏连患者子宫内膜组织中miR-543、miR-135a水平，分析二者在不同预后患者中表达差异，探究其对宫腔黏连患者术后再复发的评估价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年9月-2019年9月本院收治的行宫腔镜术治疗的中、重度宫腔黏连患者。纳入标准：①经宫腔镜或B超检查确诊为中、重度宫腔黏连[6]；②出现反复流产、闭经、月经量减少等症状；③已婚，且有妊娠需求。排除标准：①有宫内节育器使用史；②合并子宫肌瘤、宫颈息肉等；③肝、肾功能严重不足及患有免疫系统疾病、精神疾病。本研究经本院伦理委员会批准同意。患者均签署知情同意书。

1.2 治疗方法

患者均行宫腔镜手术治疗。B超监控下使用环形电极进行肌性或纤维组织黏连切除，异物钳取出黏连组织。以宫腔镜下宫腔形态恢复正常且两侧宫角、输卵管清晰可见开口为手术成功标准。根据患者术后状况和意愿行置入球囊导尿管治疗(球囊组)：宫腔内置入球囊导尿管注入5 ml生理盐水，留置宫腔72 h后取出，防止宫腔再黏连。球囊导尿管取出后放置宫内节育器，未行球囊导尿管治疗患者(对照组)术后宫腔内放置节育器，两组均术后常规抗生素预防感染和3个月人工周期治疗(口服戊酸雌二醇片30 d，6mg/d；口服黄体酮胶囊5d，200mg/d)。

1.3 miR-543、miR-135a检测

术中置入宫腔镜后，使用环形电极直视下刮除黏连组织表面少量内膜和黏连组织后，将组织和环形电极退回套鞘一同退出宫腔，避免其他部位内膜损伤和影响。留取子宫内膜组织，液氮冷冻后-80℃保存备用。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测患者子宫内膜组织中miR-543、miR-135a、沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)mRNA、转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达水平。20 μl反应体系：cDNA 2 μl，上、下游引物各2 μl，SYBR Primix Ex TaqTM10 μl，ROX 0.4 μl，ddH2O 3.6 μl。反应步骤：95℃ 7 min，1循环；95℃ 15 s，62℃ 35 s，73℃ 15 s，40个循环，1个样品行3个重复。采用2-△△CT法计算miR-543、miR-135a、SIRT1 mRNA、TGF-β mRNA相对表达量。miR-543、miR-135a以U6为内参基因，SIRT1 mRNA、TGF-β mRNA以GAPDH为内参基因，实验所用引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 随访

术后3个月宫腔镜复查，记录患者宫腔恢复、妊娠及其他症状。统计宫腔镜治疗1年后再复发率。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 临床资料及随访情况

入组患者78例，年龄(32.0±4.6)岁(27～39岁)，病程(8.4±2.4)月(3～25月)；中度黏连52例，重度黏连26例。治疗后随访1年，复发23例(复发组)、未复发55例(未复发组)，妊娠31例，其中足月妊娠24例。复发组与未复发组年龄、体质指数(BMI)、病程、孕次、手术时间等无差异(P>0.05)，重度黏连、术前月经量过少、术前闭经比例及术前宫腔操作次数等复发组高于未复发组(P<0.05)。见表2。

2.2 内膜组织中各检测指标比较

复发组子宫内膜组织中miR-543、miR-135a表达水平均低于未复发组，SIRT1 mRNA、TGF-β mRNA水平高于未复发组(均P<0.05)。见表3。

表2 两组临床资料比较

表3 两组内膜组织中各检测指标表达水平比较

2.3 内膜组织中各检测指标水平相关性

子宫内膜组织中miR-543、miR-135a均与SIRT1 mRNA、TGF-β mRNA水平呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 子宫内膜组织中各检测指标水平相关性

2.4 影响宫腔镜治疗后复发的危险因素

以本研究资料为样本，以宫腔镜治疗后患者是否复发为应变量(复发=1，未复发=0)，以表1、表2中差异有统计学意义的指标/因子为自变量建立logistic回归模型。结果如表5所示，重度黏连、术前宫腔操作次数多、高SIRT1 mRNA和高TGF-β mRNA水平、低miR-543和低miR-135a水平是影响宫腔黏连患者宫腔镜治疗后复发的独立危险因素(P<0.05)。

表5 影响宫腔黏连患者宫腔镜术治疗后复发的危险因素分析

2.5 内膜miR-543、miR-135a预测治疗后复发

如图1所示，预测宫腔黏连患者宫腔镜治疗后再复发，miR-543曲线下面积为0.829(95%CI：0.734～0.924)，当截断值0.73时预测敏感度为82.6%、特异度为78.2%；miR-135a曲线下面积为0.798(95%CI：0.685～0.912)，当截断值0.69时预测敏感度为78.3%、特异度为83.6%。二者联合预测的曲线下面积为0.856(95%CI：0.771～0.924)，敏感度为91.3%，特异度为74.5%。

图1 miR-543、miR-135a预测宫腔镜治疗后复发的ROC曲线

3 讨论

有研究报道，子宫内膜基底层损伤后子宫内膜自身修复过慢，引起子宫内膜纤维化，导致宫腔黏连发生[1]。因此与子宫内膜损伤修复相关的炎症反应、纤维化、新生血管生成等机制均与宫腔黏连发生发展密切相关。

有研究报道，子宫内膜异位症患者子宫内膜中miR-543表达水平明显下调，与黏连情况有关，可能影响胚胎植入[7]。本研究显示，宫腔镜术后复发组者子宫内膜组织中miR-543表达水平低于未复发组，与Yang等[7]在子宫内膜异位症中的研究结果相似，提示miR-543可能与宫腔黏连发生发展及其预后有关，miR-543降低可能预示发生再复发的几率较大。有研究发现，miR-543可通过调节p53等基因表达参与骨髓纤维化进展，影响耐药高危型骨髓纤维化患者预后[8]。有研究证实，脊髓损伤模型大鼠中miR-543过表达可通过抑制NF-κB通路下调炎症因子水平和改善神经再生[9]。推测本研究中miR-543可能通过影响患者子宫内膜纤维化进程及炎症反应增加，促进宫腔黏连复发等预后不良发生，但其具体作用机制有待探究。

上皮间质转化是子宫内膜纤维化的重要机制，胃癌细胞中miR-543过表达可通过靶向下调SIRT1水平抑制上皮间质转化和自噬，导致细胞迁移和侵袭[10]。研究报道[11]，糖尿病视网膜病变患者视网膜内皮细胞中miR-543高表达可通过下调SIRT1促进血管生成。本研究发现，术后复发组子宫内膜组织中SIRT1 mRNA水平高于未复发组，且miR-543与SIRT1 mRNA水平负相关，提示miR-543下调可能通过调控SIRT1表达影响宫腔黏连再发生。研究报道，TGF-β在宫腔黏连组织修复和纤维化进展中发挥重要作用[12]。有研究发现，SIRT1表达增加可靶向上调TGF-β促进人皮肤成纤维细胞活化和迁移[13]。本研究复发组子宫内膜组织中TGF-β mRNA水平较未复发组升高，miR-543与TGF-β mRNA水平负相关，提示miR-543与SIRT1调控关系可能通过靶向TGF-β发挥作用。

Mirabutalebi等[14]研究表明，miR-135a在子宫内膜异位症中表达降低，与子宫内膜损伤和患者月经周期异常有关，可能作为诊断和治疗的生物标志物。本研究结果显示，与未复发组相比，复发组子宫内膜组织中miR-135a水平明显降低，提示miR-135a低表达可能通过反映子宫内膜损伤严重程度，预示宫腔黏连患者宫腔镜治疗后复发等预后不良发生。Li等[15]在胶质瘤研究中报道，下调miR-135a表达可促进上皮间质转化发生，促进癌细胞增殖和迁移。胃癌进展中过表达miR-135a可明显抑制肿瘤血管生成[16]。推测本研究中miR-135a可能通过调控上皮间质转化、血管生成等进程参与宫腔黏连患者术后复发发生。有研究报道，肺腺癌患者miR-135a低表达，可诱导SIRT1上调，进而促进癌细胞体内和体外增殖[17]；miR-135a可靶向TGF-β下调胶原纤维蛋白表达，抑制心肌纤维化进展[18]。本研究显示，子宫内膜组织中miR-135a均与SIRT1 mRNA、TGF-β mRNA水平呈负相关，提示miR-135a低表达可能通过SIRT1、TGF-β相关作用通路影响宫腔黏连患者术后复发。

本研究中，重度黏连、术前宫腔操作次数多、高SIRT1 mRNA水平、高TGF-β mRNA水平、低miR-543水平、低miR-135a水平等影响患者宫腔镜治疗后复发的独立危险因素，且子宫内膜组织中miR-543、miR-135a联合预测对治疗后复发有一定诊断价值。

综上所述，宫腔黏连宫腔镜治疗后复发患者子宫内膜组织中miR-543、miR-135a表达水平更低，对预测治疗后复发有一定评估价值。但由于本研究研究方法较为简单，miR-543、miR-135a在宫腔黏连术后复发进展中相关作用机制尚需深入研究。