lncRNA ANRIL和VEGF在原因不明复发性流产绒毛中表达

杨炜婷 温 芯 胡洪梅 黄 勇

四川省凉山州第一人民医院( 615000)

原因不明复发性流产(URSA)是妇产科常见妊娠并发症[1-2]。发生涉及到多种因素机制尚不明确。有研究表明，绒毛血管增生、滋养细胞增殖、侵袭对妊娠建立和维持非常重要，其异常可能导致流产发生[3]。血管内皮生长因子(VEGF)在妊娠早期胎盘绒毛组织的血管形成、发育过程中起重要作用[4-5]。细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA(ANRIL)属长链非编码RNA(LncRNA)，与肿瘤细胞增殖、迁移过程密切相关[6]。妊娠滋养细胞的生物学行为与肿瘤细胞相似，但lncRNA ANRIL、VEGF在URSA中的关系研究较少。本研究通过检测lncRNA ANRIL、VEGF在URSA患者绒毛中表达，探讨在URSA发病中的可能作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年8月-2019年6月在本院就诊的URSA患者62例(观察组)，同期要求行人工流产术正常早孕者62例(对照组)。纳入标准：①单胎妊娠。②观察组有腹痛、阴道流血等先兆流产症状，经B超检测证实无胚胎心脏跳动；对照组无腹痛、阴道流血等先兆流产症状，B超检查提示为正常宫内妊娠且胚胎发育正常。③妊娠≤12周，观察组连续自然流产≥3次。排除标准：①有生殖系统异常、慢性高血压、糖尿病、肾脏疾病、心血管疾病、甲状腺疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、妊娠并发症。②有家族复发性流产病史、外科手术和医疗并发症史。③有染色体、解剖、内分泌、感染、免疫方面原因。④服用过药物或男方精液检查不正常。⑤临床资料保存不完整者。⑥服用药物。本研究经本院伦理委员会审核并批准。所有研究对象及家属签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

TRIzol试剂购自北京百奥莱博科技有限公司；逆转录试剂盒购自北京华大蛋白质研发中心有限公司；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司。qRT-PCR仪(Prism 7500)购自美国应用生物系统公司；紫外分光光度计(UV-1800PC)购自上海美谱达仪器有限公司。lncRNA ANRIL、VEGF、GAPDH引物均由华大基因科技有限公司设计并合成。

1.3 绒毛组织采集与保存

观察组行清宫手术、对照组行人工流产术时采集新鲜胎盘绒毛组织，用生理盐水反复冲洗，分成两份，置液氮中速冻，-80℃保存。

1.4 lncRNA ANRIL、VEGF mRNA检测

使用TRIzol试剂提取绒毛组织总RNA，紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量、完整性，合格后使用逆转录试剂盒将总RNA样品逆转录成cDNA，检验cDNA质量，合格后采用qRT-PCR法检测lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平。内参基因为GAPDH基因。10 μl反应体系：Green Mix 5 μl，50 ng/μl cDNA 1 μl，10 μM上下游引物各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反应条件：95℃ 90 s；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 15 s，40个循环终止。lncRNA ANRIL上游引物：5'-TACCATACAACAGACCAGAA-3'，下游引物：5'-TTGTTTTTCCAACATCCAT-3'；VEGF上游引物：5'-TGGATCCATGAACTTTCTGCTGTC-3'，下游引物：5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACA-3'；GAPDH上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'。lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平以2-ΔΔCt法表示，Ct值为扩增产物量达到临界阈值时对应的循环数。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组年龄、体质指数、孕周、孕囊大小、先前流产次数比较无差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组绒毛组织中lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平

绒毛组织中lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平观察组均低于对照组(P<0.05)。见图1、表2。

2.3 观察组绒毛组织中lncRNA ANRIL与VEGF mRNA表达相关性

相关性分析显示，观察组绒毛组织中lncRNA ANRIL与VEGF mRNA表达水平呈显著正相关(r=0.484，P<0.05)。见图2。

表2 两组绒毛组织中lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平比较

图1 两组绒毛组织中lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达电泳图

图2 URSA患者绒毛组织中lncRNA ANRIL与VEGF mRNA表达相关性

2.4 影响URSA发生的多因素分析

将URSA发生作为因变量，以URSA患者绒毛组织中lncRNA ANRIL和VEGF mRNA表达水平为自变量进行多因素logistic回归分析。结果显示，绒毛组织中lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平均为影响URSA发生的保护因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响URSA发生的多因素分析

3 讨论

URSA易导致早期流产发生，再发生风险随流产次数的增加而增加，长此以往可导致不孕不育[7]。既往研究表明，妊娠过程中胚胎着床、植入、发育需要达到母体、胚胎间的免疫平衡，故免疫治疗成为了URSA的主要研究方向，但临床治疗中仍有30%～40% URSA患者无效。有研究表明，URSA的发生机制与绒毛中血管形成障碍、胚胎缺血缺氧有关[8]。妊娠早期绒毛中血管形成是胚胎成功种植及正常发育的重要前提，有助于滋养细胞侵入子宫内膜，并在妊娠全过程中保障胚胎发育。当绒毛中血管形成障碍时，会引起绒毛外滋养细胞侵袭障碍及胚胎植入发育异常，最终导致流产发生[9]。

Ferretti等[10]研究发现，滋养层细胞增殖、迁移、侵袭特性与肿瘤细胞极其相似。lncRNA在多种恶性肿瘤中异常表达，通过影响细胞周期、改变肿瘤相关基因的表达及干扰miRNA功能等途径，参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等生物学过程[11]；秦妮娜等[6]研究表明，使用丙泊酚抑制lncRNA ANRIL表达可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖与迁移；吴浩等[11]研究表明，抑制肝癌细胞中lncRNA ANRIL表达可显著降低肝癌细胞的增殖能力；贺小云等[12]研究表明，lncRNA在胚胎形成、妊娠建立、激素调节、早期胚胎发育等阶段均发挥重要作用，但研究多集中在动物繁殖方向。崔进等[13]研究表明，lncRNA在复发性流产和正常妊娠人工流产者间存在差异。本研究结果显示，URSA患者绒毛组织中lncRNA ANRIL表达水平较正常妊娠者低，提示绒毛组织lncRNA ANRIL参与URSA发病过程，可能与滋养层细胞的增殖、侵袭过程有关。

VEGF可促进绒毛新生血管形成及滋养细胞增殖、迁移[14]。其表达水平下降会导致血管内皮细胞增殖发生障碍，血管通透性下降，绒毛、蜕膜血管生成产生缺陷，最终导致胚胎停止发育并流产[15-16]。尹太郎等[3]研究表明，mRNA通过靶向调控VEGF表达，调控绒毛血管发育，参与复发性流产发病过程。吴成平等[7]研究亦表明，复发性流产患者胎盘绒毛组织中VEGF表达异常下调可能是引起复发性流产发生的重要原因。高玉霞等[17]研究表明，URSA患者绒毛组织中VEGF mRNA表达水平较人工流产者低，且随着URSA患者流产次数的升高而降低。本研究结果显示，URSA患者绒毛组织中VEGF mRNA表达水平较正常妊娠者低，提示绒毛组织VEGF低表达可能是导致URSA发生的一个重要因素。

陈日红等[18]研究表明，LncRNA ANRIL可能通过调控VEGF表达参与增生型糖尿病视网膜病变过程。Zhang等[19]研究表明，在大鼠模型中，lncRNA ANRIL过表达后通过上调VEGF表达，促进糖尿病合并脑梗死大鼠血管生成。本研究进一步分析发现，URSA患者绒毛组织中lncRNA ANRIL与VEGF mRNA表达水平呈正相关，提示lncRNA ANRIL可能通过调控VEGF表达下调，导致URSA患者绒毛新生血管形成、滋养细胞侵袭过程发生障碍。多因素分析显示，绒毛组织中lncRNA ANRIL、VEGF mRNA水平均为影响URSA发生的保护因素，提示lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平异常下降可能是导致URSA发病的重要因素。

综上所述，URSA患者绒毛组织中lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平异常下调，可能二者共同作用影响URSA发生，但其具体作用机制还待进一步研究。