复发性流产患者外周血FOXP3 mRNA、RORγt mRNA表达及临床诊断价值

高艳霞 郑玉霞

辽宁省健康产业集团抚矿总医院(抚顺，113000)

目前认为复发性流产(RSA)发生与生殖器官异常、内分泌异常、遗传因素及孕妇全身性疾病等有关[1]。自然妊娠属特殊的同种异体移植，胚胎可产生免疫应答，提高母体免疫抑制功能细胞数量，维持机体免疫耐受[2]。既往研究表明[3-4]RORγt在RSA中发挥作用，不仅能激活机体免疫，亦可刺激内皮细胞、成纤维细胞直接机体炎症反应。而FOXP3属CD4+CD25+T细胞发育和功能维持的重要调节因子，特异性表达于CD4+CD25+T细胞[5]。但FOXP3mRNA、RORγt mRNA在RSA的诊断效能研究较少[6]。因此，本研究以RSA患者、健康早孕女性及健康体检女性为对象，探讨外周血中FOXP3mRNA、RORγt mRNA的表达特点。

1 资料与方法

1.1 研究对象

纳入标准：①RSA诊断符合相关标准[7]，所有夫妇染色体核型、妇科检查、甲状腺功能检查等均未见异常；②完成外周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA检查且可耐受；排除标准：①合并精神异常、血液系统疾病或自身免疫性疾病；②合并甲状腺功能异常、黄体功能异常及恶性肿瘤；③合并认知功能障碍、器质性疾病疾病或凝血异常。选择2018年1月-2019年12月本院就诊的RSA患者为RSA组，产前检查健康早孕女性为健康早孕组，健康体检女性为健康体检组。本研究经本院伦理委员会审批。研究对象知情同意。

1.2 检查方法

RSA组入院后次日取外周血，健康早孕组和健康体检组健康于体检当天取外周血。

1.2.1 FOXP3mRNA、RORγtmRNA 取血清标本加入Trizol 500μl，充分混合后转移到离心管1.0ml振荡5min后静置。加入氯仿200μl振荡15s，静置5min后离心15min。去上清液，加入预冷的75.0%乙醇1ml，常温下7min干燥；紫外分光度仪A260测吸光度值。采用实时荧光PCR技术测定外周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA水平。设置PCR参数：30℃下10min；42℃下30 min；99℃下5 min；5℃下5 min，连续35个循环，72℃下10min延长，获最终产物并放入1.5%琼脂凝胶电泳，β-actin为内对照，引物见表1[8-9]。

表1 引物设计

1.2.2细胞因子取血清标本，采用酶联免疫吸附试验测定各组白细胞介素-6、7(IL-6、7)、人胸腺活化调节趋化因子17(CCL17)、CC趋化因子受体4 (CCR4)水平[10]。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 一般临床资料

RSA组106例，年龄(28.6±3.5)岁(23～39)岁，自然流产(3.7±0.7)次(2～6)次，孕周(9.1±0.8)周(3～13)周；健康早孕组39例，年龄(28.6±3.5)岁(22～35)岁，孕周(9.1±0.8)周(3～12)周；健康体检组42例，年龄(28.0±3.4)岁(23～35)岁。3组比较无差异(P>0.05)。

2.2 外周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA表达

RSA组FOXP3mRNA水平高于健康体检组但低于健康早孕组，RORγtmRNA水平高于另外两组；健康早孕组FOXP3mRNA水平高于健康体检组，RORγtmRNA水平高于健康体检组(均P<0.05)。见表2。

2.3 外周血中IL-6、7、CCL17、CCR4水平

RSA组IL-6、IL-7水平高于另外两组，CCL17和CCR4水平低于健康早孕组但高于健康体检组；健康早孕组IL-6、7、CCL17、CCR4水平高于健康体检组(均P<0.05)。见表3。

表2 各组外周血中mRNA表达比较

表3 各组外周血检测因子水平比较

2.4 FOXP3mRNA、RORγtmRNA诊断RSA效能

ROC曲线分析，FOXP3mRNA联合RORγtmRNA诊断RSA的敏感性、特异性均高于各单一检测(P<0.05)。见表4和图1(211页)。

表4 各检测指标诊断RSA的效能

3 讨论

目前临床将RSA分为同种免疫性与自身免疫性两种：自身免疫性RSA多与系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征等自身免疫疾病有关；同种免疫性RSA多与妊娠免疫耐受有关。因此，加强RSA患者早期诊断、治疗对改善患者预后具有重要意义。

RSA的发生发展是一个多因素过程，多与人体免疫功能有关，尤其是T淋巴细胞。在正常人体中，外周血、脾脏组织CD4+T细胞中5%～10%的细胞高表达，临床称为CD4+CD25+T，在维持机体免疫稳定性中发挥重要作用，不仅能抑制自身免疫病的发生，亦可参与妊娠免疫调节[11]。本研究中，RSA组FOXP3mRNA水平高于健康体检者但低于正常早孕妇女，RORγtmRNA水平高于另外两组，说明FOXP3mRNA、RORγtmRNA在RSA的发生发展中发挥了重要作用。Treg细胞是CD4+T淋巴细胞的亚群，能特异性表达FOXP3，能作为Treg特异标志物。既往研究表明Treg能抑制机体免疫细胞表达。妊娠者免疫耐受的形成、维持是一个多因素过程，而Th17能直接参与机体免疫炎性反应的调节。RORγt属Th17细胞特异性转录因子，在分化成熟的Th17细胞中呈高表达，能控制Th17细胞分化。Treg细胞与Th17细胞相互作用、相互影响而抑制炎症和促进炎症，调节机体免疫平衡，维持免疫稳态。对RSA患者能引起Treg细胞减少或Th17细胞增多，加强炎症反应，发挥免疫负性调节作用，导致免疫稳态失衡，加剧疾病的发生发展[12]。本次研究显示，RSA组IL-6、IL-7水平均高于另外两组，CCL17及CCR4水平低于健康早孕组但高于健康体检组。提示RSA患者外周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA呈高表达，有炎症因子参与加速疾病的发生发展。ROC曲线分析结果表明，FOXP3mRNA联合RORγtmRNA检测诊断RSA的敏感性、特异性较高，可用于复发性流产的诊断。

综上所述，外RSA患者周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA表达异常，可能与机体免疫紊乱有关，检测这两项指标能获得较高的诊断RSA效能。