薏苡仁中黄曲霉毒素G1的动态表面增强拉曼光谱检测

任 菲，于治国*，陆 峰

(1.沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016;2.第二军医大学 药学院，上海 200082)

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉菌的某些菌株产生的一类致突变、致癌的次级代谢产物[1]。黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)是其中具有代表性的一员，其毒性仅次于黄曲霉毒素B1(AFB1)，国际癌症研究机构将黄曲霉毒素G1列为2B类毒素[2]。据报道，我国华北地区具有高发病率的肺癌和食管癌与黄曲霉毒素G1存在很大联系[3]。进一步研究表明，黄曲霉毒素G1通过诱导AT-Ⅱ细胞DNA氧化损伤导致小鼠肺癌的发生[4]。薏苡仁中药材在生长、采集、储藏以及加工过程中易造成霉菌及霉菌毒素的污染，产生较多的黄曲霉毒素等霉菌毒素[5]。如诸晨等[6]在对比不同产地薏苡仁的黄曲霉毒素含量中发现安徽一批薏苡仁中黄曲霉毒素G1含量高达149 μg/kg，是黄曲霉毒素B1的4倍。同时薏苡仁为药食两用常用中药材，使用范围广、用量大。因而对薏苡仁中黄曲霉毒素G1的监控具有重要意义。

目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)[7-8]、高效液相色谱法(HPLC)[9]、液相色谱-质谱联用检测法(LC-MS)[10]、薄层色谱法(TLC)[11]等。这些方法虽有较高的灵敏度和准确度，但样品提取和分离过程复杂，且净化小柱的价格高昂，检测时间长，仪器耗损大。因此，亟待建立一种适用于中药材中黄曲霉毒素的快速且简便的现场检测方法。

表面增强拉曼光谱(SERS)是指光照射到纳米级别的粗糙贵金属(如金、银等)的表面，引起拉曼信号显著增强的异常光学增强现象[12]。SERS技术具有灵敏度高，荧光背景低，检测速度快，提供化学指纹信息，仪器尺寸小适合现场分析等优势，从而广泛应用于药品、食品、环境等领域。动态表面增强拉曼光谱技术(D-SERS)是在纳米溶胶从湿态转变到干态过程中实时进行的光谱采集，比SERS信号增加了2～3个数量级。本文利用简单的擦拭法提取薏苡仁表面的黄曲霉毒素G1，以纳米金为活性基底，采用D-SERS法检测中药材中黄曲霉毒素G1，该方法快速、简便，在大批量样品的现场分析中具有良好的应用潜力。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、柠檬酸钠(C6H5Na3O7)及碘化钾(KI)购自国药集团化学试剂有限公司。黄曲霉毒素G1(bepure®)。实验用水为去离子水。薏苡仁中药材购买于药店。

BWS415-785H便携式拉曼光谱仪(必达泰克光电科技(上海)有限公司)，激发波长为785 nm，光谱分辨率为3 cm-1，光谱测量范围为0～3 000 cm-1。Smart-D UV扫描电子显微镜(德国Carl-Zeiss公司)。

1.2 金溶胶的制备

金溶胶参考经典柠檬酸钠还原氯金酸法制备并稍作改动[13]：向100 mL去离子水中加入4.8 mL 1% HAuCl4水溶液，边搅拌边加热，待其沸腾时迅速加入4.3 mL 1%柠檬酸钠溶液，继续加热搅拌，10 min后停止反应，自然冷却至室温，将所得酒红色溶液倒入棕色瓶中储存备用，制得50 nm金溶胶。

1.3 样品前处理及D-SERS检测

取约2.0 g中药材薏苡仁，喷洒不同量黄曲霉毒素G1溶液并烘干，得薏苡仁中黄曲霉毒素G1的含量分别为8、20、40、80、160、320 μg/kg。乙腈作为润湿剂润湿薏苡仁表面，再用滤纸擦拭表面，将擦拭后的滤纸浸入乙腈中，并充分涡旋，让附着在滤纸表面的黄曲霉毒素G1溶于乙腈。然后去除滤纸，将剩余乙腈溶液挥干，加入乙腈复溶。得到从薏苡仁表面提取的黄曲霉毒素G1浓缩液。

将金溶胶浓缩20倍后，加入10 μL 1 mmol/L KI溶液，并孵育30 min，与黄曲霉毒素G1提取浓缩液等量混合，滴在硅片上，将便携式拉曼光谱仪的激光持续聚焦在液滴表面，激发波长为785 nm，激光功率为20%，积分时间为5 s，进行D-SERS信号采集。

2 结果与讨论

2.1 金溶胶的表征

金属纳米粒子的尺寸、表面粗糙度等因素会影响其光学性质，因此对所制备的水相金溶胶进行扫描电镜(SEM)和紫外光谱(UV-Vis)表征。结果显示，制备的金纳米颗粒呈球形且分布均匀，粒径约为50 nm(图1A)，紫外最大吸收波长在536 nm处(图1B)。

图1 纳米金的扫描电子显微镜图(A)及紫外吸收光谱(B)Fig.1 SEM image(A) and ultraviolet absorption spectra(B) of gold nanopartieles

2.2 黄曲霉毒素G1的D-SERS光谱与特征峰归属

将配好的金溶胶与2 μg/mL黄曲霉毒素G1溶液等体积混合，取2 μL混合液滴于硅片上，激光聚焦在液滴中间，采集光谱直到液滴完全变干，整个过程得到的D-SERS光谱如图2所示。由图可见，黄曲霉毒素G1信号呈递增趋势，达到最大值后维持一段时间，然后信号逐渐减弱甚至消失。此规律由杨良保等[14]最先发现：随着溶剂的不断挥发，纳米颗粒间距离不断缩小，因此在第一阶段湿态下，待测物的信号不断增强。当纳米颗粒间距达1～10 nm时，进入了第二阶段，即临界状态，此时所形成的热点有较高的均匀度和较强的捕获能力，使得检测具有较高的灵敏度和重现性。随后纳米粒子间的距离进一步缩短，热点也逐渐减少，拉曼信号迅速减弱，直到液滴完全变干，热点消失。因此，临界状态具有一定的一致性和稳定性，选择该状态的光谱进行SERS检测和分析十分可靠。

图2 黄曲霉毒素G1的D-SERS光谱Fig.2 D-SERS spectrum of aflatoxin G1

表1 黄曲霉毒素G1的SERS光谱及固体标准品的常规拉曼光谱(NRS)的谱峰归属Table 1 SERS vibration modes attribution of aflatoxin G1 and normal raman spectrum(NRS) of solid standard

2.3 薏苡仁中黄曲霉毒素G1检测方法的建立

由于中药基质复杂，若直接从中药粉末中提取总的黄曲霉毒素G1再进行D-SERS检测，会得到很多中药成分的干扰峰，甚至会覆盖黄曲霉毒素G1的特征峰。因此，实验选择擦拭法提取中药表面的黄曲霉毒素G1。这一方面是因为擦拭法是用滤纸擦试经过润湿的中药表面，仅提取附着在表面的黄曲霉毒素G1，相比其他方法需复杂的提取步骤以及固相萃取除去大部分中药成分具有操作简单、快速的优点；另一方面，擦拭法仅带走药材表面的成分，使得基质的复杂性以及含量均大幅减少，从而降低了对黄曲霉毒素G1检测的干扰。

取6份薏苡仁，分别喷洒不同量黄曲霉毒素G1，得到薏苡仁中黄曲霉毒素G1的含量分别为8、20、40、80、160、320 μg/kg。在优化条件下，采用乙腈作为润湿剂润湿药材表面，取0.5×0.5 cm2大小的滤纸擦拭药材表面，再将滤纸浸入乙腈，然后将乙腈溶液挥干并复溶，得到含有系列浓度的黄曲霉毒素G1的薏苡仁提取浓缩液，并进行D-SERS检测，结果如图3所示。经过与空白对照对比发现，在薏苡仁成分的干扰下，黄曲霉毒素G1的大部分特征峰与干扰发生重叠，仅1 303 cm-1处信号无干扰，且信号较强，容易识别，因此选择1 303 cm-1作为薏苡仁中黄曲霉毒素G1的定性定量特征峰。另外，随着黄曲霉毒素G1浓度的增大，黄曲霉毒素G1的其他特征峰如1 475 cm-1和1 617 cm-1逐渐显现并且响应也呈递增趋势，而薏苡仁的干扰峰相应地减弱。这可能是因为当黄曲霉毒素G1浓度足够高时很容易占据金纳米颗粒所形成的热点，若更多的黄曲霉毒素G1进入热点，就会与薏苡仁的成分竞争热点，从而使薏苡仁的干扰峰相应减弱，进而凸显出黄曲霉毒素G1的特征峰。由于1 303 cm-1处的响应随着黄曲霉毒素G1浓度的递增也呈递增趋势，因此以1 303 cm-1处特征峰峰强度(y)对应薏苡仁中黄曲霉毒素G1的含量(x，μg/kg)绘制标准曲线，发现黄曲霉毒素G1在8～320 μg/kg浓度范围内呈良好的线性，线性方程为y=239.1x+1 730.7，相关系数(r2)为0.985 5(图4)，检出限(LOD，S/N=3)为5.5 μg/kg。传统的液相色谱法前处理复杂，处理时间较长，还耗费大量有机溶剂，本方法虽在灵敏度略显不足，但具有快速、简单等优势。另外，擦拭法提取薏苡仁表面的黄曲霉毒素G1并进行D-SERS分析，可达到灵敏性检测要求，具有在现场快速检测中药材中黄曲霉毒素G1的能力。

图3 薏苡仁中不同含量的AFG1的D-SERS光谱Fig.3 D-SERS spectrums of different contents of AFG1 in coix seed

图4 10份样品中检测AFG1的重现性Fig.4 Reproducibility of aflatoxin G1 in 10 samples

2.4 薏苡仁中黄曲霉毒素G1检测的重现性

实验对真实样品进行模拟染毒时，即黄曲霉毒素G1溶液喷洒在药材表面并挥干，发现黄曲霉毒素G1会有少量渗入药材内部，这与中药材真实发霉的情况相符。因此在采取擦拭法提取药材表面的毒素时会存在提取率降低和重现性差的问题。因此实验同法配制了10份含有40 μg/kg 黄曲霉毒素G1的薏苡仁，在优化条件下采用擦拭提取和D-SERS检测。结果发现，1 303 cm-1处特征峰的相对标准偏差(RSD)为11%，表明图谱的差异性符合要求，该方法具有良好的重现性，可满足薏苡仁中黄曲霉毒素G1的现场快速检测。

3 结 论

本文采用擦拭法提取，建立了薏苡仁中药材中黄曲霉毒素G1的D-SERS快速分析方法。在优化条件下，AFG1在8～320 μg/kg范围内具有良好的线性，LOD为5.5 μg/kg。方法具有节约成本、快速、操作简单等优势，十分适合大批量样品的现场实时快速分析，可为D-SERS技术在中药材中黄曲霉毒素G1的检测及开发奠定基础。