分散微固相萃取/超高效液相色谱-高分辨质谱法测定茶叶中高氯酸盐

2021-05-17方从容赵云峰陈达炜李敬光

分析测试学报 2021年4期

韦昱，方从容，赵云峰，陈达炜，李敬光

(国家食品安全风险评估中心/卫生部食品安全风险评估重点实验室，北京 100021)

高氯酸盐作为一类新型环境污染物普遍存在于环境和食品中，人类活动排放是其主要来源，如航天燃料、烟花爆竹，以及含氯消毒剂、化肥、除草剂的生产使用。高氯酸盐对人体的危害主要是引起甲状腺功能减退而导致一系列疾病[1-5]。环境中的高氯酸盐以不同形式进入水和土壤后，可被茶树吸收富集，导致茶叶中高氯酸盐含量增加。近年来，中国超90%的茶叶检出高氯酸盐，平均含量为100～200 μg/kg，最高可达1 600 μg/kg[6]。目前，食品安全国家标准尚未对茶叶中高氯酸盐的限量进行规定，但2020年5月欧盟委员会规定茶叶中高氯酸盐的最大残留量为750 μg/kg[7]。建立有效、简便的茶叶中高氯酸盐检测方法对于安全饮茶至关重要。

茶叶中高氯酸盐的检测方法主要包括离子色谱法[8]、离子色谱-串联质谱法(IC-MS/MS)[9-10]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[11-13]等。由于茶叶中高氯酸盐的含量多为痕量级别，且考虑到仪器的普适性，LC-MS/MS成为一种较优选择。茶叶富含茶多酚、生物碱、氨基酸等多种生物活性物质，在质谱检测分析中易对高氯酸盐产生基质效应影响，因此对样品有效净化是关键步骤[14-16]。目前，茶叶中高氯酸盐的样品前处理多采用分散固相萃取法(DSPE)和固相萃取法(SPE)。其中，DSPE法是应用固体吸附剂吸附茶叶提取液中的干扰物质，如石墨化碳黑(GCB)被应用于茶叶样品前处理以检测高氯酸盐[17]，但该方法净化效果不佳；吸附型SPE法是应用固体吸附剂吸附茶叶中的高氯酸盐进而获取较优的净化效果，然而寻找一种合适的有效吸附剂存在困难，十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、TPT、亲水亲脂平衡聚合物(HLB)等类型的SPE柱对纯化水、牛奶、水果、蔬菜等样品中的高氯酸盐提取效果良好，但不适用于基质复杂的茶叶样品[18]。因此，文献报道多采用通过型SPE法，即通过固体吸附剂完成对干扰物的吸附，这在一定程度上降低了净化效果。此外，SPE法的成本较高，需要淋洗、平衡和浓缩等程序，操作不够简便。

分散微固相萃取(DMSPE)是基于DSPE和SPE技术，将固体吸附剂分散于提取液中吸附目标分析物，进而再洗脱的原理，提高了复杂基质样品的净化效果[19-20]。Zhang等[19]采用DMSPE技术，将混合吸附剂(强阳离子交换吸附剂PCX和强阴离子交换吸附剂PAX)成功应用于海水中脂溶性海洋毒素的富集和净化。该技术操作简便，各吸附剂之间可混合使用，是优化茶叶样品前处理的潜在方法之一，但其应用鲜有报道。基于茶叶中高氯酸盐检测的现状与难点，本研究采用DMSPE技术对茶叶样品进行前处理，优化了吸附剂及前处理条件，并结合超高效液相色谱-高分辨质谱(UHPLC-HRMS)技术，建立了茶叶中高氯酸盐的测定方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱-高分辨质谱仪(U3000/Q Exactive，美国Thermo-Fisher公司)；涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)，高速离心机(美国Sigma公司)。

高氯酸盐标准溶液(1 000 mg/L，上海Sigma公司)，18O4-高氯酸盐同位素内标溶液(200 mg/L，加拿大TRC公司)；质谱级乙腈和甲醇(美国Fisher Scientific 公司)，HPLC级甲酸、乙酸和氨水(美国Tedia公司和上海安谱公司)；实验用水由纯水仪(美国Millipore公司)制备。阴离子交换吸附剂乙二胺基-N-丙基(PSA，平均粒径40～60 μm，比表面积480 m2/g)、PAX(平均粒径40～60 μm，比表面积600 m2/g)、PWAX(平均粒径40～60 μm，比表面积600 m2/g)、SAX(平均粒径50 μm，比表面积550 m2/g)、NH2(平均粒径40～60 μm,比表面积550 m2/g)以及阳离子交换吸附剂PCX(平均粒径30 μm,比表面积600 m2/g)、SCX(平均粒径50 μm，比表面积600 m2/g)购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；GCB(美国Agilent公司)。5种微孔滤膜(混合纤维素膜、尼龙膜、聚四氟乙烯膜、聚醚砜膜和聚酯膜)购自上海Sigma和安谱公司。本研究于2017年至2018年间，从中国福建、安徽、云南、湖北和浙江省的当地超市收集了86份茶叶样品，经粉碎均质成粉末并密封，于-20 ℃下储存。

1.2 标准溶液的配制

准确移取适量高氯酸盐标准溶液(1 000 mg/L)，用乙腈稀释配制高氯酸盐标准中间溶液(10、1 mg/L)。准确移取适量18O4-高氯酸盐同位素内标溶液(200 mg/L)，用乙腈稀释配制18O4-高氯酸盐同位素内标中间溶液(1 mg/L)。吸取适量标准中间溶液和内标中间溶液，用乙腈稀释成质量浓度为0.05～50 μg/L标准工作溶液，内标质量浓度为2 μg/L。

1.3 样品前处理

准确称取1.0 g茶叶样品于15 mL离心管中，加入40 μL内标中间溶液(1 mg/L)静置30 min。加入3 mL水，涡旋混合30 s，加入7 mL乙腈混匀后，超声提取20 min。以8 000 r/min离心5 min后，移取1.0 mL上清液于装有吸附填料(50 mg PSA和50 mg PCX)的2 mL离心管中，涡旋混匀30 s，使高氯酸盐吸附于填料上，弃去上清液，而后用2.0 mL 5%氨水溶液进行洗脱，并将洗脱液以13 000 r/min离心5 min后，待分析。

1.4 仪器分析条件

本研究仪器分析条件的优化参见前期工作[11]，获取的最优仪器参数条件如下：

色谱条件：Poroshell 120 PFP色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)，柱温：40 ℃，流速：0.6 mL/min，流动相A为甲醇，流动相B为1.0%乙酸水溶液。梯度洗脱程序：0～0.8 min，10% A；0.8～2.2 min，10%～100% A；2.2～2.5 min，100% A；2.5～4.0 min，100%～10% A。进样量：5 μL。

质谱参数：采用加热电喷雾离子化方式(HESI)；喷雾电压为2 800 V；毛细管温度为325 ℃；加热温度为400 ℃；鞘气压力为45 arb(465.3 kPa)，辅助气压力为10 arb(104.3 kPa)；负离子采集模式，靶向单一离子监测(TSIM)/数据依赖质谱(ddMS2)扫描模式；TSIM采集分辨率为70 000 FWHM，自动增益控制为2e5，最大注射时间为100 ms，分离宽度为5 Da；ddMS2采集分辨率为17 500 FWHM，Loop Count为1，TopN为2，碰撞裂解能量为150%。高氯酸盐的定量离子为m/z98.948 5，定性离子为m/z82.953 4和84.950 4；18O4-高氯酸盐同位素内标的定量离子为m/z106.968 0。

2 结果与讨论

2.1 DMSPE吸附剂的优化

DMSPE技术结合了SPE和DSPE技术的优势，但仍基于固液吸附原理，因此选择合适的吸附剂是DMSPE技术的研究重点。GCB常被用作SPE和DSPE吸附剂对高氯酸盐进行净化，但由于其对不同复杂基质中高氯酸盐及18O4-高氯酸盐内标物质的吸附存在一定差异，从而影响检测的准确度[21]。本研究考察了GCB对茶叶提取液中高氯酸盐及18O4-高氯酸盐内标物质的吸附行为，结果显示GCB对加标茶叶提取液中高氯酸盐及18O4-高氯酸盐内标物质的吸附率分别为45%(图1A)和56%，说明GCB不适合作为茶叶中高氯酸盐的DMSPE吸附剂。

高氯酸盐是一种阴离子化合物，带阳离子基团的吸附剂对其具有较好的吸附效果，因而，本研究分别考察了50 mg的PSA、PAX、PWAX、SAX和NH2作为离子交换吸附剂对加标茶叶提取液中高氯酸盐(100 μg/L)的吸附效果(见图1A)。结果显示，PSA对高氯酸盐的吸附效果较差，吸附率仅为38%，而其它4种吸附剂由于具有相对较高的比表面积，对高氯酸盐的吸附效果较优(85%～96%)。进一步考察了PSA对无基质的纯溶剂高氯酸盐标准溶液的吸附效果，发现高氯酸盐的吸附效果有所提高(62%)，这说明PSA更易吸附茶叶中的干扰物，使得吸附位点被占据而导致对茶叶基质中高氯酸盐的吸附效果较差。

图1 不同吸附剂对茶叶提取液中高氯酸盐(100 μg/L)的吸附率(A)与解吸附率(B)(n=3)Fig.1 Adsorption rate(A) and desorption rate(B) of different adsorbents on perchlorate in tea extract(100 μg/L)(n=3)

本研究选择2.0 mL的5%甲酸水溶液和5%氨水溶液分别对已吸附高氯酸盐的PSA、PAX、PWAX、SAX和NH2吸附剂进行洗脱，结果表明，2种洗脱剂均无法将目标分析物从PAX、PWAX、SAX和NH2吸附剂上较好的洗脱，解吸附率均低于50%(图1B)。基于上述研究结果，单独使用这5种吸附剂均无法获取较佳的吸附或解吸附效果。值得注意的是，PSA与其它4种吸附剂有所不同，虽对高氯酸盐的吸附效果不佳，但所吸附的高氯酸盐可得到较好洗脱(98%)。

本研究尝试将PSA与其它类型吸附剂联用，以更好地获得高氯酸盐的吸附和解吸附效果。首先，将PSA与其它4种相同类型的阴离子交换吸附剂(PAX、SAX、PWAX和NH2)联用，结果发现这些联合吸附剂同样对高氯酸盐具有较好的吸附效果，但无法获取较佳的解吸附效果。其次，选择2种阳离子交换吸附剂(PCX和SCX)与PSA联用，并采用基质匹配标准溶液对其进行考察。结果发现，单独使用PCX或SCX对高氯酸盐几乎无吸附作用，但与PSA联用后，均能改善单独使用PSA对高氯酸盐的吸附效果，吸附率升至90%，说明PCX或SCX的作用可能是通过吸附茶叶中的干扰物，从而释放更多的PSA吸附位点，进而提高吸附率。在解吸附率考察中，采用2 mL的5% 氨水溶液洗脱能使高氯酸盐在PSA和PCX联合吸附剂上的解吸附率达到95%。然而，SCX与PSA联用的解吸附率相较于PCX有所下降(87%)，分析其原因可能是PCX具有更细的平均粒径，对于茶叶中干扰物的吸附较SCX更佳，从而获取的基质效应更低。综上，本研究以PSA与PCX联用作为DMSPE吸附剂。

2.2 DMSPE条件的选择

本研究考察了联用吸附剂PSA和PCX的不同质量比(1∶0.5、1∶1和1∶2)对基质溶液中高氯酸盐吸附和解吸附效果的影响。结果发现，在这3种质量比例下，高氯酸盐均能获取较佳的吸附效果，但比例为1∶1和1∶2的解吸附效果(>93%)均优于1∶0.5(82%)的解吸附效果。因此，考虑到价格成本和解吸附效果，确定选择PSA和PCX的质量比为1∶1。

此外，通过对茶叶提取液中100 μg/L高氯酸盐的分析，优化了吸附剂用量、洗脱溶剂体积和氨水比例(见图2)。图2A结果显示，高氯酸盐的提取回收率随着吸附剂用量的增加而逐渐提高，当用量≥50 mg时，提取回收率达到88%以上并趋于平衡。图2B结果显示，2.0 mL的5%氨水溶液足以将吸附剂上的目标分析物洗脱完全。图2C结果表明，随着洗脱液中氨水的比例逐步提高，高氯酸盐的提取回收率有所提高，5%的氨水溶液即可获取最佳的洗脱效果。因此，本研究最终选择50 mg PCX和50 mg PSA为混合吸附剂，以2.0 mL的5%氨水溶液进行解吸附。

图2 不同DMSPE条件下高氯酸盐的回收率(n=3)Fig.2 Recoveries of perchlorate at different DMSPE conditions(n=3)A：amount of adsorbent;B：volume of eluent;C：proportion of ammonium hydroxide

2.3 基质效应

茶叶样品中的复杂基质可能增强或抑制高氯酸盐的离子强度，进而影响定量分析的准确性。将空白茶叶样品按“1.3”方法进行前处理，制得茶叶空白基质溶液。分别用5% 氨水溶液和茶叶空白基质溶液配制质量浓度为0.05～50 μg/L的系列标准工作溶液，作为纯溶剂标准溶液和基质匹配标准溶液，并采用本方法进行分析。依据基质匹配标准曲线与纯溶剂标准曲线斜率的比值评价基质效应，即斜率比值接近1.0时，表明基质效应较弱，斜率比值在0.8～1.2之间为可接受的基质效应。上述标准曲线的斜率比值为0.93，说明该方法的基质效应可忽略不计。因此，本研究采用纯溶剂标准曲线完成对茶叶中高氯酸盐的分析。

2.4 方法选择性

本研究通过分析不同空白样品中测定目标物的特异性(n=6)来考察方法选择性。图3显示，高氯酸盐的保留时间附近未发现基质干扰峰，说明本方法具有较好的选择性。值得注意的是，在质谱仪器检测前，往往需用微孔滤膜去除样品分析液中可能存在的细小微粒，以避免色谱柱堵塞。考虑到高氯酸盐作为普遍存在的环境污染物，可能通过污染的微孔滤膜进而引入样品分析液中，导致对样品中高氯酸盐含量的假阳性检测或高估结果。为此，比较了5种不同品牌或类型的微孔滤膜(混合纤维素膜、尼龙膜、聚四氟乙烯膜、聚醚砜膜和聚酯膜)，分别用1 mL的5%氨水溶液洗脱。结果发现有3份分析液(混合纤维素膜、尼龙膜和聚酯膜)中分别检出质量浓度为2.7、8.3、14.1 μg/L的高氯酸盐。因此，样品分析液不采用微孔滤膜过滤，而是采用13 000 r/min高速离心5 min，以避免高氯酸盐或其它离子的背景干扰。

图3 高氯酸盐的提取离子色谱图Fig.3 Extracted ion chromatograms of perchlorateA：blank tea extract;B：1.0 μg/L of matrix-matched standard solution;C：spiked extract at LOQ level

2.5 线性范围、检出限与定量下限

配制质量浓度为0.05～50 μg/L的高氯酸盐系列标准溶液，内标法定量，内标18O4-高氯酸盐的质量浓度为2 μg/L。采用本方法进行分析，以系列标准溶液的质量浓度为横坐标，高氯酸盐与其同位素内标的提取离子色谱峰峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示高氯酸盐在0.05～50 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)为0.999 7。

对茶叶空白基质溶液进行低水平加标实验，分别以3倍和10倍信噪比(S/N)对应的加标水平为检出限(LOD)与定量下限(LOQ)。高氯酸盐在茶叶中的LOD为0.4 μg/kg，LOQ为1.2 μg/kg，远低于欧盟对茶叶中高氯酸盐750 μg/kg的限量值，该方法可满足茶叶中高氯酸盐的检测要求，适用于茶叶中痕量高氯酸盐的风险评估。

2.6 准确度与精密度

本研究选择空白茶叶进行加标回收实验，以考察方法的准确度和精密度。选定加标水平分别为1.2、12、120 μg/kg，按照“1.3”和“1.4”方法处理后上机测定，每个加标水平每日平行测定6次，连续测定3日。结果显示，高氯酸盐在3个加标水平下的回收率为87.4%～105%，日内相对标准偏差(RSDr)为0.30%～6.1%，日间相对标准偏差(RSDR)为4.2%～9.2%(见表1)，说明本方法的准确度和精密度良好。

表1 茶叶中高氯酸盐的回收率与相对标准偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviations for perchlorate in tea

2.7 方法比较

目前，茶叶中高氯酸盐的检测主要采用IC-MS/MS和LC-MS/MS法。与已报道的分析方法相比，如邓家军等[6]所综述的茶叶中高氯酸盐的方法LOQ在2～3 000 μg/kg之间，Liu等[18]报道的方法LOQ为10 μg/kg，Wang等[17]报道的方法LOQ为5 μg/kg，本研究所建立的方法具有更低的LOQ(1.2 μg/kg)。尽管Zhao等[12]报道的方法具有更低的LOQ(8.21 ng/kg)，但样品前处理使用的QA-Mag-CCNTs吸附剂需要自制。本研究所用的吸附剂均已商品化，较易获取。此外，本研究采用DMSPE净化技术，可较大程度去除茶叶中的复杂干扰物，获得更低的基质效应。同时，由于DMSPE技术是采用分散式吸附型净化，吸附填料可自行组合，相较于商业化的SPE柱，操作更简捷，且成本更低[21]。

2.8 实际样品的测定

采用已建立的方法对86份茶叶样品进行检测，结果见表2。茶叶中高氯酸盐的检出率为91.9%，检出含量为3.8～1 073 μg/kg，平均含量为163 μg/kg。此外，在一些茶叶样品中检测到高含量的高氯酸盐，根据欧盟规定的限量值(750 μg/kg)，8份茶叶样品中高氯酸盐超过限量，检测含量为841～1 073 μg/kg。