蓖麻内源防御肽的MALDI-MSI方法及溯源应用研究

何唯唯，王晨钰,2，杨捷威，徐 斌*，郭 磊*，谢剑炜

(1.军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850；2.中央民族大学 药学院，民族医学教育部重点实验室，北京 100081)

工业油料作物蓖麻(Ricinuscommunis，R.communis)具有很高的经济价值，蓖麻植株在国际范围内，包括中国南北均广泛分布[1]。误用或蓄意使用蓖麻籽引发的中毒暴露事件屡有发生，另外，蓖麻毒素信件多次引发社会恐慌[2]。蓖麻籽中除富含蓖麻油酸(占总含油量的90%)外[3]，还含有糖、蓖麻油酸、蓖麻碱、蓖麻防御肽、蓖麻毒素(0.1%～0.5%)、蓖麻凝集素、储存蛋白等多种物质，其中蓖麻毒素为剧毒性生物毒素，对小鼠的半数致死剂量(LD50，静脉注射)为5～10 μg/kg，对成人的半数致死剂量为1～20 mg/kg(口服)，成人口服8～12个蓖麻籽即可致死[4-8]。蓖麻凝集素亦存在较高毒性，但其毒性较蓖麻毒素低2～3个数量级。因此，纯化的蓖麻毒素、蓖麻籽的毒素粗提物以及蓖麻籽等均为误服、蓄意投毒等蓖麻中毒或威胁事件的潜在来源。

不同制备工艺、不同产地的蓖麻籽溯源等是蓖麻中毒相关事件剖析确证中的必要环节。除了剧毒性的蓖麻毒素、蓖麻凝集素之外，值得注意的是，蓖麻防御肽，又称肽类生物标志物(R.communisbiomarkers，RCB)，广泛存在于不同品种的蓖麻籽中[8]，其序列与植物防御素高度相似，可能在种子萌发前的过程中发挥保护作用，抵御真菌和细菌等病原体的入侵[9]，与蓖麻籽的毒性机制存在一定相关性。

近年涌现的基质辅助激光解吸电离-质谱成像(Matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry imaging，MALDI-MSI)技术，在组织学水平上将质谱提供的分子结构信息与成像技术提供的空间分布信息相结合，可实现组织切片中各种分子的无标记、高灵敏、高通量检测和定位，从而在分析化学、生物医学领域中备受关注[10]。在植物生物学领域[11]，已出现应用质谱、串联质谱和MSI技术对植物组织中的肽类及蛋白质等进行结构鉴定、丰度测定、定位及分布等整合性分析研究。例如，针对3个品种桃子的果皮部分，阐述了变应原Pru p3蛋白及其差异性分布[12]；在番茄种子中发现4种不同亚型的非特异性脂质转运蛋白，并揭示其定位信息[13]；在茄科植物中发现新型、不均匀分布的环肽等[14]。李灵军课题组[15]基于MALDI-MSI方法，对苜蓿中的数百个内源性肽及蛋白质片段进行了从头测序(Denovo)及可视化研究，揭示了不同发育阶段的空间分布变化。可见，MSI技术为植物生长和胁迫应答过程中新类型肽类生物标志物的发现及潜在防御机制等研究提供了新的研究视角[16]。

对于不同品种、产地的蓖麻籽，其内源性潜在生物标志物的组织定位、空间分布以及产地之间的特征差异比较研究尚属空白。本研究以3种RCB为靶向标志物，首次利用其在种子内高丰度存在、无明显细胞毒性的特点，在系统探讨和优化冷冻切片、基质喷雾方法及各参数条件的基础上，建立了蓖麻籽的二维(Two-dimension,2D)及三维(Three-dimension,3D)MALDI-MSI分析策略。该方法安全可靠，易于推广。进一步选择中国两大类典型种植环境代表产地—山西(华北地区，北纬34°～40°，东经110°～114°)、四川(华南地区，北纬26°～34°，东经97°～108°)来源，应用于两地蓖麻籽的RCB可视化研究(图1)，初步揭示了MALDI-MSI方法在蓖麻籽产地溯源研究的潜在应用价值。

图1 蓖麻籽样品制备、内源防御肽的MALDI-MSI方法及数据分析策略示意图(★为关键步骤)Fig.1 Schematic diagrams of sample preparation of castor beans,MALDI-MSI towards three defense peptides,and data processing,where pentagram represents the key point

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF质谱仪(配备SmartbeamTM固态激光器，激光波长355 nm，采样频率200 Hz，含FlexControl、FlexAnalysis、FlexImaging、SCiLS Lab 2020a Premium 3D软件)，ImagePrep声波雾化自动基质喷雾仪、氧化铟锡(ITO)导电载玻片，均为德国Bruker Daltonik公司产品。CM 1950低温冷冻切片机(德国 Leica公司)，Perfection V370高分辨切片扫描仪(日本EPSON公司)，Tecan M1000 PRO酶标仪(瑞士Tecan公司)，CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司);ID 602空气压缩喷雾器、ID A2超声微网喷雾器(北京氧精灵公司)。

α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA，99%)购自德国Bruker公司；羧甲基纤维素钠(CMC，平均分子量25 000)为化学纯，购自上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈、甲醇(质谱纯)购自德国Merck公司。冷冻包埋剂OCT由德国Leica公司提供；RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Thermo Fisher公司；CCK-8增强型试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(上海)。人宫颈癌HeLa模型细胞株由军事医学研究院抗毒药物与毒理学国家重点实验室提供，蓖麻籽购自山西、四川药材市场。

1.2 细胞增殖抑制实验

HeLa细胞以1×104个/孔的密度在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。分别设置1～400 pmol/L的蓖麻毒素阳性对照组以及1 nmol/L～1 mmol/L的RCB 1～3和空白对照组，每组5个复孔。培养24 h后，培养基与CCK-8试剂体积比为10∶1，孵育1 h后在450 nm波长下用酶标仪测定各孔OD值，计算细胞存活率：细胞存活率=(测量值-空白组)/(对照组-空白组)×100%。

1.3 三种RCB的从头测序及结构模拟

对组织切片中的RCB进行原位二级质谱鉴定。将终浓度为0.1 mol/L的二硫苏糖醇(DTT)加至7 g/L的HCCA基质中，37 ℃孵育30 min后，在LIFT碎裂反射正模式下分别对RCB标准肽段和组织切片进行原位RCB二级质谱鉴定分析。数据通过Biotools软件进行de novo分析，并与Sequence Editor软件构建的参考序列进行对比。RCB 1(PDB ID 2MTM)的结构来自蛋白数据库(PDB)，RCB 2和RCB 3通过与RCB 1比对，再通过Pymol分子可视化软件模拟得出。

1.4 组织切片制备与基质喷涂

将蓖麻籽剥去种皮，沿冠状面夹开，尽量保持种子的完整性。然后将去皮的蓖麻籽浸泡于4% CMC中，于4 ℃冰箱内浸泡5日。使用时小心用镊子夹出完整的半枚蓖麻籽(即其一片子叶)，用4% CMC包埋，调节切片厚度为20 μm，并在-20 ℃下切割。将切下的薄片迅速转移至ITO涂覆的导电玻片表面，切片发生融化并在CMC黏性作用下固定于玻片。真空干燥10 min后备用。对于3D重构，针对半枚种子，从外部种皮向内制备矢状面切片，每7个切片等间距选择一片，构成连续切片序列。

精密称取适量的HCCA粉末并溶于50%的乙腈-水溶液中，配制成终质量浓度为7 g/L的HCCA基质溶液，体系内另加0.2%(体积比)的三氟乙酸(TFA)。将配制好的HCCA基质溶液均匀覆盖在组织切片上。

1.5 MALDI-MSI分析

选择正离子反射模式对组织切片样品进行质谱数据采集，设置检测质荷比范围为m/z1 000～4 000。每个采样点激光照射400次。扫描空间分辨率为50 μm。使用Flex Analysis 3.4及Flex Imaging 4.1进行数据预处理，再采用SCiLS Lab 2020a Premium 3D软件进行MSI图像构建，包括降噪、谱图归一化及质谱峰获取，继而进行相关性矩阵分析、主成分分析(Principle components analysis，PCA)。

2 结果与讨论

2.1 三种RCB的质谱鉴定及细胞毒性评价

植物防御素是植物种子中的一类多肽及小分子蛋白，通常分子量小于10 kDa，一级序列中存在多个半胱氨酸(Cysteine，Cys)残基，且均以二硫键相连[9,17-19]。本文首先对蓖麻籽中3个RCB序列进行从头测序分析(图2)，RCB 1～3分子量在2 kDa左右，均含有4个Cys残基，序列上高度相似[8,20]。其中，RCB 1(含19个氨基酸)与RCB 2(18个氨基酸)序列同源性为94.7%(RCB 1多出19Ser)，RCB 2(18个氨基酸)与RCB 3(18个氨基酸)序列同源性为94.4%(RCB 3为7Leu，而RCB 2为7Met)。

图2 3种RCB的一级结构序列[6](A)、三维结构模拟(B，青色代表β-转角，蓝色代表二硫键)以及MALDI-MS/MS二级质谱鉴定比对(C～E，C:RCB 1;D:RCB 2,E:RCB 3)Fig.2 The amino acid sequences[6](A),the simulated structures(B,where the cyan and blue lines mark the 3D structures of β-turns and the corresponding disulfide bonds,respectively),and the de novo sequencing in MALDI-MS/MS(C-E,C:RCB 1;D:RCB 2,E:RCB 3) of three RCBs

RCB 1的二级质谱图中很难得到m/z1 000～1 500间的碎片信息，结合Boldbaatar等[20]的前期研究，笔者认为RCB 1具有稳定的三级结构，其二硫键增强了其β-转角附近的稳定性，从而使其源内裂解电离稳定性增强。对于RCB 1～3，在DTT还原性条件下，C端Cys附近及N端1Ala附近的二级质谱裂解效率略有提高。最终获得了N端前6～7个残基以及C端后4～5个残基的阳性片段，可鉴定出3种RCB在种子中的存在。此外，发现序列中部10Pro-Pro-Phe-Ala难以碎裂，可能由β-转角结构中脯氨酸残基较稳定所致。

同时，选择常用真核细胞模型—HeLa细胞，以CCK-8细胞增殖实验获取对3种RCB细胞毒性的认识。结果表明，阳性对照—蓖麻毒素可显著抑制HeLa细胞的生长，24 h后半数抑制浓度(IC50)约为20 pmol/L，而RCB 1～3则无明显细胞毒性，IC50均>300 μmol/L。

2.2 蓖麻籽组织切片的制备

蓖麻籽的含油量高，组织质软，连续、完整的组织切片存在一定难度，需在制备前实施充分浸泡。另外，需要兼顾两种不同产地来源的蓖麻籽的特性，即山西来源的种子颗粒稍大，质硬且较完整；四川来源的种子颗粒较小，质较软、易碎。需选择适宜的浸泡液和包埋剂。

笔者发现，常用组织包埋剂OCT在MALDI-MSI检测的多肽质荷比范围(m/z1 000～4 000)内会产生大量谱峰，严重干扰目标肽类检测。另外几种MALDI-MSI常用的包埋剂—蔗糖、明胶、水和CMC中，CMC对m/z1 000～4 000 Da范围内基本无干扰，且自身可提供较高粘度，使得在切片制备过程中所造成的分析物位移可基本忽略，较适用于蓖麻籽切片包埋。CMC本身亦可提供合适的分子网络，同时可作为蓖麻籽的浸泡液，从而利于提高切片干燥后的强度[21]。但当CMC浓度低于4%、浸泡4日或以下时限时，均无法获得良好组织结构的组织切片，最终选取4% CMC浸泡5日后获得致密度适宜的种子。

组织切片厚度对结构完整性及质谱成像质量存在关键影响。本文在10～30 μm范围内选择了14、20、25、30 μm四个厚度的组织切片，进行相同条件下的样品制备和基质喷雾。结果表明，最适宜的蓖麻组织切片厚度为20 μm。当组织切片厚度小于20 μm时，切片上易产生较多空洞，难以保持结构完整性，造成切片中RCB 1～3的损失，质谱峰强度较低；而切片厚度大于20 μm时，组织结构相对完整，但灵敏度降低，其原因可能与样品表面与导电靶板间的电阻过高，分析物的电离效率降低相关(如图3A)。

2.3 基质喷雾条件的优化

2.3.1 基质喷雾方式的选择比较了3种雾化器—空气压缩喷雾器、超声微网喷雾器和ImagePrep声波雾化基质喷涂仪的喷雾均匀性和基体消耗效率。结果表明，两种低成本的市售医用喷雾器(空气压缩喷雾器、超声微网喷雾器)可形成较ImagePrep更为微小的喷雾液滴；但基质晶体的均匀性及重复性要逊于ImagePrep(见表1、图3B)。

图3 组织切片厚度(A)及基质喷雾方式(B)对3种RCB谱峰强度的影响Fig.3 Influence of the thickness of sections(A) and the matrix deposition modes(B) on mass spectrum intensities of three RCB

表1 3种基质喷雾方式的效果比较Table 1 Comparison of the matrix deposition effects among three different spraying modes

2.3.2 基质喷雾条件的优化本文对ImagePrep基质喷雾的3个主要参数，即基质厚度(Matrix thickness)、孵育时长(Incubation time)及湿度(Wetness)进行了系统优化。基质厚度体现为利用喷雾仪的光学传感器监测并转换出的始末电压差值，与消耗的基质总量直接相关，影响组织切片表面的分析物的共晶及电离效率；孵育时长即在每次完整喷雾循环过程结束、停止气流干燥后，基质与切片共孵育的间隔时长，其对基质与分析物形成共晶的影响显著，但若孵育时长过长，会明显增加整体喷雾时间；湿度为每次喷雾循环开始时，残留于组织切片的湿度，亦称为干燥强度。

进行了三因素三水平L9(33)正交实验，因素和水平分别为：基质厚度(0.3、0.5、0.7 V)、孵育时间(10、30、50 s)、湿度(26.67%、40%、53.33%)。最终确定用于MALDI-MSI的最佳基质喷雾参数组合为，基质厚度0.5 V，孵育时间30 s，湿度53.33%。三个因素中，孵育时长对谱峰强度的影响最为显著，基质厚度其次，湿度影响则相对较低。

2.4 基于MALDI-MSI对不同产地蓖麻籽的检测

2.4.1 山西、四川蓖麻籽中RCB的丰度及空间分布比较如图4所示，山西来源和四川来源的蓖麻籽，在m/z1 000～4 000 范围内的谱峰分布和强度存在明显差异。3种RCB所在的m/z1 900～2 100 区段，基本无其它多肽干扰，提示RCB独特的生物标志物价值。山西来源种子中的内源肽在m/z1 900～2 600范围内丰度较高，包含了3种RCB；四川来源种子中的内源肽在m/z1 100～1 300范围内则较为集中。山西来源种子中3种RCB的含量均多于四川来源。对于蓖麻籽的正中冠状面，其MALDI-MSI的整体丰度分析表明，山西来源的蓖麻籽中RCB 3丰度最高，且RCB 3>RCB 2>RCB 1；而四川来源的蓖麻籽中RCB 2丰度最高，且RCB 2>RCB 3>RCB 1，两种来源的RCB 1均含量最低。

图4 山西、四川来源的蓖麻籽中RCB 1～3的质谱强度(A～B,A：山西来源，B：四川来源)、空间分布(C)及相对丰度(D，紫色为山西，黄色为四川。四川来源的RCB丰度为×10后的结果)Fig.4 Overall MS peaks(A～B,A is Shanxi's,B is Sichuan's),the spatial distribution(C),and the relative contents of the three RCBs(D) in the castor beans from Shanxi's(yellow bars) and Sichuan's(purple bars) in the 2D MSI,in(D) the yellow bars were shown as a zoomed in view of Sichuan's data at 10-fold magnification

MALDI-MSI还可给出3种RCB更多的分布信息。这3种高度相似的多肽均分布于种子的内层，主要为胚乳和胚芽部位，外部种皮部位则分布较少。

2.4.2 山西来源蓖麻籽中RCB分布及3D重构本文将20片组织切片的2D MSI结果进行3D重构，进一步比较了山西来源的2D及连续间隔切片的3D空间重构结果。图5结果显示，3种RCB的分布均呈现以下整体性规律：切片1～3接近种子外种皮，切片面积较小，RCB在切片1～3中均存在分布；切片4～11位于种子胚乳处靠近胚芽的一端，面积略大于切片1～3，RCB相对丰度较低，主要分布于胚乳部分，而胚以外的部分较少；切片12～20的面积逐渐递增，RCB整体处于胚乳、胚芽部分。从种皮到胚，RCB呈先减少后增加的趋势，但于种子中部的丰度最高，主要为胚乳、胚芽，这与RCB的冠状面分布规律基本一致，较为清楚地证实了MALDI-MSI方法的可靠性。

图5 以3种RCB表示的山西来源种子纵向切片的2D(A～B,A：丰度；B：成像)及3D MALDI-MSI图(C～D,C：连续间隔切片；D：半片山西种子的叠合重构)Fig.5 Three RCB' longitudinal distribution of Shanxi's by total intensity(A),2D MSI abundance(B),3D MALDI-MSI(C) and 3D reconstruction structure of half a Shanxi's seed(D)

另一方面，通过 3D MSI对上述20片组织切片进行立体重构，可直观地观察到RCB主要分布在胚乳及胚芽中。成熟种子胚乳为营养器官，蓖麻毒素及其凝集素[22]、高丰度的蓖麻油酸同样富集于胚乳中[23]。

2.5 MALDI-MSI数据分析进一步提示RCB的溯源价值

如图6A所示，在m/z1 000～4 000 范围内针对两地来源的蓖麻籽组织切片进行MALDI-MSI采集，分别得到内含1 180及1 008个质谱峰的502及579张谱图，其中多数为多肽的质谱峰。首先选择在山西、四川蓖麻籽中均存在且丰度较高的14个代表性m/z进行相关性矩阵分析，发现3种RCB之间存在高相关性，且显著高于其中任何一种其它内源性物质的相关系数，从统计学角度印证了3种RCB的内在联系。

进一步利用PCA对所有的质谱峰进行降维处理。结果如图6B所示，前3个主成分(Principle components,PCs)的贡献分别为23.86%、9.73%及6.06%，三者共呈现了39.64%的分布趋势。整体上，山西与四川蓖麻籽3个PC所代表的分布趋势呈现显著差异；主成分负载数据中，3种RCB均归属于贡献度最高的PC1。提示RCB应可做为山西、四川蓖麻籽溯源中的生物标志物。3D MSI成像的PCA分析结果表明，前3个PC共可贡献94.16%的主要分布趋势，涵盖3种RCB的PC1则贡献了51.55%的典型性分布。进一步说明具有高度内在联系的RCB 1～3作为一组整体的肽类生物标志物，在溯源分析方面存在较高价值。

图6 非靶向数据挖掘(A：14种山西、四川来源蓖麻籽中共有内源肽的相关性矩阵，*表示3种RCB；B：山西、四川来源蓖麻籽中典型质谱峰的PCA分析；C：20片山西来源蓖麻籽中典型质谱峰的PCA分析)Fig.6 The non-targeting MSI data mining.(A) Correlation heatmap of all pairs of the 14 representative m/z values in Shanxi's and Sichuan's.RCB 1-3 are indicated by asterisks(*),(B) PCA results of the seeds' section from Shanxi's and Sichuan's,(C) the PCA results of the 20 serial sections from Shanxi's castor bean

3 结 论

本研究针对蓖麻相关公共安全事件的响应处置需求，试图从蓖麻内源防御肽RCB的角度出发，揭示RCB的组织分布和空间定位与产地溯源间的内在联系。通过利用首次建立的2D及3D MALDI-MSI方法，明确了RCB的空间分布及丰度差异，并发现RCB 1～3对中国南北来源的蓖麻籽溯源可产生较高贡献度。考虑到蓖麻毒素呈剧毒毒性，需要特定的安全防护，而3种防御肽RCB并未呈现明显真核细胞毒性这一特点，表明RCB可作为一组安全、灵敏的生物标志物，无需借助任何其它特定的辅助步骤(如：胰蛋白酶酶切后肽段定位揭示毒素蛋白差异分布、特定基质辅助小分子代谢物的差异成像，等)，便可更为简便、直观地助力于中毒事件种子来源的溯源分析。MSI增加了“空间分布”这一维度特征，更适用于准确地区分内源性组分丰度相似、产地环境相似的蓖麻籽。进一步研究可集中于扩大溯源产地范围，并测试该MALDI-MSI策略的适用性和可靠性，以及开展蓖麻毒素、蓖麻凝集素、蓖麻碱、蓖麻油酸以及蓖麻籽内脂质小分子等多种类型分子的空间分布分析，并将其与蓖麻毒素的毒性机制相结合，从而为法医学、食品安全和环境安全等提供更全面的科学依据。