食源性致病菌的表面增强拉曼光谱检测技术研究进展

俞 婷，周宝梅，徐 敏，耿玉闯，刘洪林

(合肥工业大学 食品与生物工程学院，安徽 合肥 230601)

食源性致病菌(比如沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等)引起的疾病是全世界最重要的公共安全问题之一，也是全球食源性疾病高发病率和死亡率的重要因素。2015年世界卫生组织发布的全球食源性疾病负担估算报告[1]显示：2010年，全球发生约6亿起食源性疾病，其中以非伤寒肠道沙门氏菌为主的病原体造成约23万人死亡，而实际发生的疾病数量可能是报告数量的300～350倍。此外，有研究对食源性致病菌引起的疾病发病率进行估计[2]，认为我国每年约有1亿人患细菌性食源性疾病，然而由于报告体系不健全，监测系统报告的发病人数远少于此数据。从以上现状来看，迫切需要一种高效、快速的致病菌检测技术用于现场或临床检测，以达到预防、控制食源性疾病，完善食源性疾病监测系统的目的。

细菌培养法是一种常用的致病菌检测方法，样品中的致病菌经过几天的增菌、分离培养后，可根据菌落特征、生化试验或血清学鉴别判定致病菌种类，通过平板计数法对致病菌进行定量。但这种方法步骤复杂且耗时长，在等待培养结果时，不能明确病菌类别，通常使用广谱抗生素对患者进行非针对性的过度治疗，限制了紧急情况下食源性疾病的诊断和控制。近年来，聚合酶链式反应[3-4]、酶联免疫吸附测定[5]等技术被越来越多地应用于食源性致病菌检测，大大缩短了检测时间。然而，这些技术仍存在假阴性、假阳性、步骤复杂、检测成本高等问题，限制了其在现场或临床诊断上的广泛应用。因此，为了公共安全和人类健康、减少细菌耐药性的产生，亟需发展一种简便、快速、准确的致病菌检测方法。

表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)技术具有灵敏度高、荧光背景低、前处理简单、快速无损等优点，在化学与生物传感等领域有广阔的应用前景，目前已被广泛应用于检测食品中农药残留、非法添加物、毒素等[6-9]，在致病菌种类和耐药性检测方面也表现出应用潜力，有望发展成一种被广泛接受的检测技术。本文综述了近5年来利用基于标签和无标签SERS技术检测食源性致病菌的研究进展，介绍了常用的SERS活性纳米结构，讨论了SERS在实际样品检测中的应用；最后，对该技术目前存在的问题及今后的研究趋势进行了总结和展望。

1 SERS简介

SERS是一种高灵敏的无损快检技术，当分子吸附到特定金属表面(如金或银纳米粒子)时，其非弹性光散射被极大增强。1974年，Fleischmann等[10]第一次观察到SERS现象，他们将吡啶吸附到粗糙银电极上时意外发现吡啶分子的拉曼信号增强，并把此现象归因于表面积增加导致吸附的吡啶分子数量增加而使信号增强。1977年，Jeanmaire等[11]及Albrecht等[12]均确认这一增强现象达105～106倍，远远超出分子吸附数量增加所能引起的信号增强，并提出由于电极表面效应增加了分子拉曼散射截面的观点。随后，Moskovits[13]提出这种增强由粗糙金属表面传导电子集体共振引起。经过四十多年的发展，已有大量论文对SERS机理、增强基底的设计及其在各领域的应用进行研究。这些研究使拉曼技术获得突破性进展，为克服普通拉曼散射弱的缺点提供了方法。

目前，电磁增强(EM)和化学增强(CE)是被广泛认同的两种增强机理。电磁增强是指当入射光与金属结构作用时，电磁波可以引起金属表面局域等离子体共振(LSPR)，使金属表面的局部电磁场强度增强2～5个数量级，这是SERS增强的关键。当待测分子靠近等离子体材料附近时，分子拉曼信号会显著增强，产生表面增强拉曼光谱，且SERS强度随着距离减小而逐渐增强。此外，当两个纳米颗粒足够接近时，它们可以在间隙中产生极大的SERS增强，这种空间局域化区域被称为“热点”，其增强因子最高可达1011，如此高的增强有利于检测各种共振和非共振分子[14-15]。化学增强是指被吸附在金属表面的分子中的电子与金属表面电子相互作用产生的增强，虽然化学增强的增强因子只有10～100倍，但其与电磁增强的协同关系，可以显著改善SERS的增强特性[16]。在食源性致病菌检测中，“热点”效应发挥了主要作用：金属纳米材料通过静电吸附或识别配体作用结合到致病菌表面，纳米材料之间形成丰富的“热点”，使致病菌表面分子或拉曼标签信号极大地增强，从而实现致病菌的灵敏直接或间接SERS检测。

2 SERS活性纳米结构

为达到理想的致病菌检测效果，研究人员致力于制备高灵敏、稳定、可重复、选择性好的SERS基底，大致可分为3类：

(1)纳米溶胶及其组装：金、银纳米溶胶是广泛使用的SERS基底，成本低、制备方便且SERS性能优异，金纳米颗粒形貌规则、尺寸均匀，银颗粒的SERS活性更强但不太稳定，金银核壳结构颗粒则兼顾了两者的优点[17-18]；为进一步优化SERS增强效果，研究人员制备了形态各异的纳米结构，如金纳米线囊泡[19]、刺状金颗粒[20]等，它们具有丰富的尖端，能提供更强的电磁增强。Zhou等[21]合成了骨头形状的金纳米棒(图1A)，其顶点具有更多热点，拉曼信号强度比普通金棒增强118倍；基于纳米骨的SERS传感器用于检测大肠杆菌O157∶H7，检测限可低至3 CFU/mL。此外，相比于溶胶中纳米颗粒的随机聚集，可控聚集形成的“热点”，如纳米颗粒的二聚组装[22-23]、核-卫星纳米结构[24]等，既能实现检测灵敏度又可保证检测的重现性，已引起研究人员的广泛兴趣。Wu等[23]利用带两个巯基的金属络合物合成金颗粒二聚体并修饰志贺氏菌的特异性适配体，对食品中的志贺氏菌检测表现出良好的选择性和灵敏度，检测限为10 CFU/mL。

(2)固气界面纳米结构：溶胶类SERS基底易受环境因素影响，储存稳定性相对较差，因此，有研究通过物理吸附、化学吸附或毛细力驱动等手段将纳米材料固定于玻片、聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜、滤纸[25-27]等固体衬底上来提高基底的稳定性和便携性。Qiu等[28]通过在硅片上控制纳米棒溶胶的缓慢蒸发，制得垂直的纳米棒阵列(图1B)，可提供大规模均匀、高灵敏的SERS基底，实现对单增李斯特菌、木糖葡萄球菌、屎肠球菌的无标签检测及区分。此外，还有研究通过电子束光刻法或压印法制备形状、大小、间隙可控的纳米图案[29-30]，镀上金膜后得到稳定性、均一性较好的基底。

(3)液相界面等离子体阵列：液相界面组装的纳米颗粒阵列具有可调谐、可重复、多相可及性等优点，是SERS技术实用化的突破方向之一。本课题组在水/油界面上构筑了具有界面自愈合、形状自适应的三维纳米阵列(图1C)，通过改变容器的表面浸润性实现了三维阵列对水、油两相的可逆包覆[31]；调节界面的纳米颗粒密度可优化SERS增强效果[32]。此外，我们提出了利用有机溶剂作为内标校正光谱信号的策略，实现了两相中不同溶解度分子的可靠、定量检测[33]。这种液相等离子体阵列已被成功用于食品中农药残留、油脂氧化、食用油中多环芳烃等[33-35]的检测。目前食源性致病菌检测中的基底主要为前两类，本课题组正在开展利用液相界面等离子体阵列检测致病菌的研究。

3 SERS在食源性致病菌检测中的应用

3.1 无标签的直接检测

无标签SERS检测，也称直接检测，该法通过将SERS基底直接与致病菌悬浮液进行孵育，使致病菌靠近基底表面，增强致病菌拉曼信号并获得其固有指纹信息，具有操作简便、快速、成本低等优点。由于致病菌生物组成复杂且光谱信息丰富，大多数生物分子拉曼散射截面相对较小，实际样品中杂质较多等客观因素的存在，无标记检测的研究主要致力于3个方面：(1)从复杂样品中分离致病菌，减少其他成分对致病菌SERS光谱的干扰；(2)制备灵敏度高、重现性好的SERS基底，提高无标签检测能力；(3)解析致病菌的SERS光谱，结合多元统计分析方法和机器学习算法提取光谱中有效信息，达到鉴别、分类等目的。

目前已有很多研究利用不同纳米结构测量纯培养致病菌的SERS光谱，并尝试对其特征峰归属进行分配。致病菌的SERS光谱主要来源于细胞壁的成分，包括肽聚糖、蛋白质、多糖、脂质、核酸等。一些常见的峰如649、730、958、1 030、1 241、1 325、1 457、1 580 cm-1等(归属见表1)，在不同致病菌SERS光谱中普遍存在，但由于分子含量、分布不同等原因，相对强度存在差异。如革兰氏阴性菌细胞壁中肽聚糖含量比革兰氏阳性菌少，因此革兰氏阴性菌SERS光谱中来源于肽聚糖糖苷环振动模式的730 cm-1处的峰强比革兰氏阳性菌弱[36]。由于致病菌在分子水平上组成复杂，尽管已经对一些特征峰来源进行解释，但不同研究人员给出的归属并不相同，不利于统一分析，目前仍缺乏一个完整的SERS光谱峰分配数据库。

表1 致病菌SERS光谱的拉曼位移和归属分配[36-40]Table 1 Raman shift and tentative band assignment of the SERS spectra of pathogen[36-40]

细胞壁成分差异会引起SERS光谱差异，使得不同属、不同种、同种但不同来源的菌株及耐药菌株的分类判别成为可能。然而致病菌SERS光谱指纹信息丰富，一般难以通过直接观察判别不同致病菌(图2A)，因此，大多数研究通常借助多元统计分析方法对数据进行“降维”，提取光谱中有效信息，建立分类模型。常见的方法有主成分分析(PCA)[41-42]、线性判别分析(LDA)、分层聚类分析(HCA)[43]、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)[44]。Liu等[45]利用带正电荷的金纳米棒作为增强基底，分别采集了4种假单胞菌的SERS光谱，利用PCA和LDA实现了不同种假单胞菌的分类；利用HCA得到的聚类结果与16S rRNA基因序列构建的系统进化树一致。Witkowska 等[40]在粗糙银盘表面沉积金颗粒作为SERS基底，结合PCA实现了基因组不同的单增李斯特菌菌株及基因组相同但引入了不同抗性基因的菌株的区分。对于组间差异不够明显的样品或信噪较低的光谱数据集，有研究利用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)[46-47]、遗传算法(GA)[27]或卷积神经网络(CNN)[48](图2B)滤除与分类信息无关的噪音，提取特征信息，提高模型的判别能力和效果。

图2 来自30个菌株的2 000条光谱的平均值(粗体)(A)和卷积神经网络示意图(B)[48]Fig.2 Averages of 2 000 spectra from 30 isolates(in bold)(A)and schematic illustration of convolutional neural network(B)[48]

减少实际样品中杂质干扰、获得可靠的致病菌指纹图谱是进行后续光谱分析与处理的前提。近年来，对实际样品中致病菌进行直接检测的研究相对较少，主要分为两类：(1)将纳米材料固定在硅片上，滴加样品溶液进行孵育后用超纯水冲洗除去杂质[49]；(2)利用磁性纳米颗粒从样品中分离致病菌，加入纳米颗粒采集致病菌SERS光谱[50]。捕获机制主要是带正电纳米材料与带负电致病菌之间的静电吸附作用及4-巯基苯硼酸(4-MPBA)、万古霉素与细菌细胞壁中肽聚糖的共价或氢键结合。其中，4-MPBA的特征峰会掩盖致病菌的部分特征峰[51]，虽然不影响不同种致病菌的分类判别，但可能不利于差异不大的菌种判别。利用固气界面进行检测时，近场等离子效应只能影响细菌与基底接触的界面，这意味着只有界面附近的拉曼信号可以增强。因此，Ge等[26]用修饰万古霉素的银包金纳米棒阵列捕获大肠杆菌、沙门氏菌或木糖葡萄球菌后，进一步将银纳米片沉积到细菌间隙中，尽可能获得完整的细菌指纹信息；纳米片和纳米阵列之间的协同增强提高了直接检测的灵敏度，检测限可达1 000 CFU/mL。Wang等[52]利用磁性纳米颗粒捕获致病菌后，再加入银包金纳米颗粒覆盖致病菌未被占据的表面，填补磁性颗粒与致病菌间的间隙，提供大量热点，实现了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的高灵敏检测。尽管目前研究通过直接检测获得了较低的检测限，但在致病菌浓度较低时，仅出现少数几个特征峰，虽可实现致病菌检出，但可能不利于利用算法进行分类判别。

3.2 基于拉曼标签的间接检测

无标签检测所需致病菌浓度普遍较高，得到的光谱复杂且难以分析，实现高灵敏检测和定量分析仍有一定难度，因此，目前对致病菌进行高灵敏的定性定量检测主要依赖基于标签的SERS检测方法，检测限低至几至几十CFU/mL。一般来说，检测时首先用识别配体功能化的纳米颗粒(捕获探针)从样品中捕获致病菌，然后加入修饰识别配体和报告分子的纳米颗粒(信号探针)形成“三明治”复合物，产生热点及增强的SERS信号；识别配体用于特异性捕获靶标致病菌，而报告分子的信号强度反映该致病菌的含量。常见的报告分子有4-巯基苯甲酸(4-MBA)、4-巯基吡啶(4-MPY)、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)等，报告分子有较大的拉曼散射截面和较窄的特征峰，有利于同时检测多种致病菌；也有少数报道将用于纳米颗粒功能化的蛋白[53]、DNA[54]作为报告分子。常见的识别配体有抗体和核酸适配体。目前，抗体已被广泛用于各种免疫检测试验中，其制备技术成熟，但价格昂贵、修饰困难；适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列，与抗体相比，具有合成简单、成本低、易于修饰、稳定性高等优点；但目前通过筛选得到的适配体较少，只能用于少数菌的检测。随着指数富集配体系统进化技术(SELEX)的不断进步，将来适配体可能成为抗体的潜在替代品。此外，万古霉素[55]、3-巯基苯硼酸[56-57]等小分子价格低廉，能与细菌细胞壁中的肽聚糖结合，可作为广谱识别配体与特异性抗体、适配体一起使用，不仅能降低检测成本，还不影响检测效果。

检测时为除去样品杂质及未结合的信号探针，提高检测准确性，有研究将复合物离心洗涤2～3次后采集SERS光谱[58]，但加入离心步骤增加了检测时间和程序，并在一定程度上影响探针的稳定性。近年来，磁性纳米粒子因便于分离被越来越多地应用于致病菌的SERS检测[59-61]。Li等[62]利用适配体功能化的磁性纳米颗粒作为捕获探针，通过施加外部磁场从实际样品中分离、浓缩大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，结合修饰适配体和报告分子的SERS标签，实现了样品中两种细菌的同时灵敏检测(图3A)。此外，在磁性纳米颗粒表面覆盖一层贵金属外壳制备的磁性等离子体颗粒(MPP)，同时具有磁性响应和SERS性能，在SERS传感领域具有巨大的应用前景[63]。MPP的合成方法主要有两种：(1)磁性纳米颗粒表面修饰氨基后直接吸附已合成的贵金属纳米颗粒，但纳米颗粒通常分布不均匀[64]；(2)利用化学结合或静电吸附将金种子结合在磁性颗粒表面，通过种子介导生长法在磁性颗粒周围形成连续而均匀的外壳[63,65](图3B)。You等[53]合成了壳聚糖包被的淀粉磁珠，在其表面原位合成AuNPs形成致密包裹的外层并进行抗体功能化，利用这种磁珠捕获、分离、浓缩样品中大肠杆菌O157∶H7，可以检测到单个大肠杆菌的信号，为食品中致病菌的检测提供了一种高灵敏、强有力的手段。此外，也有研究将捕获探针固定在固体支撑材料上，用超纯水或缓冲液冲洗即可除去杂质及未结合探针，无需离心及重悬等复杂步骤[25]。

图3 磁性颗粒捕获致病菌用于检测的示意图[62](A)与(B)种子生长法合成磁性等离子体颗粒示意图[63]Fig.3 Schematic illustration of magnetic particle capture for detection of pathogen[62](A)and synthesis of magnetic plasma particles by seed growth method [63](B)

基于标签的SERS检测方法已证明可以对致病菌进行高灵敏检测(表2)，但仍存在一些问题需要改进：SERS探针制备过程相对复杂且耗时久，不能长时间存放；检测时探针与致病菌孵育时间较长，通常需要1～2 h；识别配体的靶标分子在致病菌表面分布不均，导致探针分布不均，可能影响信号重现性。因此，仍需探索快速、简单、重现性好的间接检测方法。

表2 间接检测在食源性致病菌检测中的应用Table 2 Application of indirect methods in the detection of foodborne pathogens

3.3 与其他技术结合的研究

当前，结合新型样品分离和光谱解析等技术方法，发挥SERS检测手段的优势，开展致病菌检测研究是一个重要趋势。侧向流动检测(LFA)是一种免疫层析技术，具有成本低、操作简便、快速等优点，在即时检测(POCT)中受到广泛关注，但存在灵敏度低、定量分析有限的缺点。为了解决这些问题，有报道开发了基于SERS的侧向流动检测方法[67，71-74]。He等[73]合成的铂包覆的金纳米棒(AuNPs@Pt)具有较强的电磁场强度和较好的稳定性。当样品溶液被滴加到样品垫上并在毛细作用力下流动到结合区，空肠弯曲杆菌将与4-MBA、抗体功能化的AuNPs@Pt特异性结合，复合物继续流过硝酸纤维素膜至信号线被二抗捕获。在785 nm激光激发下，采集4-MBA的SERS光谱，信号强度与空肠弯曲杆菌浓度呈良好的线性关系，检测限为50 CFU/mL。此方法结合了LFA和SERS技术的优点，操作简便、快速、灵敏度高，具有很大的商业应用潜力。

基于SERS的微流控平台具有便携、样品体积小、检测速度快等优点[75]，并能提供一个较稳定的工作环境以改善SERS检测的稳定性和重复性[76]，近年来引起了研究人员的极大兴趣。此外，微流控平台可将样品预处理、富集、靶标分选、检测等多个步骤集成到一块芯片上，自动化程度高，简化了检测程序。在致病菌检测应用中，SERS与微流控技术的结合操作简单、速度快、仪器小，在快速即时分析方面具有很高的潜力且可以检测到极低水平的致病菌[77]，有望成为实际应用的突破方向之一。

近年来，以卷积神经网络(CNN)为代表的深度学习算法成为光谱分析、模型建立的一个新研究热点。CNN受动物视觉皮层中神经元复杂连接模式的启发，通常由卷积层、池化层、全联层组成，这些不同功能的层组成神经网络，逐步提取光谱数据中的特征并进行分类，在信噪比较低的光谱数据处理方面表现出强大的优势[78]。Ho等[48]将CNN应用于光谱采集时间为1 s、信噪比为4.1的30种常见临床分离株单细胞SERS光谱分析，获得了比常见分类方法更高的准确性，并能减少光谱预处理及变量选取步骤，为提高致病菌无标记检测灵敏度提供了方向。随着深度学习算法的不断优化，结合算法的SERS技术有望向更准确、广泛的方向发展。

4 总结与展望

SERS作为一种灵敏度高、快速、无损的新兴检测技术，在食源性致病菌检测方面已表现出很大的应用潜力与前景，但要发展成为一种广泛使用的快检技术，还存在一些问题和改进空间。对于直接检测而言，(1)制备超灵敏、重现性好的SERS基底仍是检测的关键；大多数研究中SERS基底与致病菌表面接触有限，采集的SERS光谱未能全面地反映致病菌指纹信息；(2)不同SERS基底、样品前处理手段、光谱采集参数及预处理方法都会影响SERS的背景、峰强度、峰位置，因此SERS方法标准化是用于实际检测的前提；(3)目前的直接检测研究均基于不同的技术和参数，得到的SERS光谱难以进行统一分析和利用。在SERS方法标准化后，应建立一个食源性致病菌光谱数据库，全面收集不同种类致病菌、不同生长阶段、承受不同环境压力时的SERS光谱以及混合菌的混合光谱，结合多元统计分析和机器学习算法对光谱数据进行挖掘和比较，为致病菌检测提供更可靠的工具。

对间接检测而言，大多数方法已能满足金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的检测需求，但检测某些限量要求严格[79]的致病菌(如沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7等)时，还需开发低至单个致病菌检测限的SERS基底。此外，实际检测时样品中非致病菌组分可能干扰检测结果，选择合适的样品前处理手段或选择性好的SERS基底仍是实际应用的前提。当前，虽然SERS技术尚未应用于实际检测，但随着SERS基底的不断优化、各种便携式和手持式拉曼光谱仪的出现以及与其他技术联用的发展，SERS有望成为一种可靠的常规技术，实现食源性致病菌的快速、现场检测，帮助预防和控制食源性疾病。