固相萃取材料在食品真菌毒素检测中的研究进展

王友法,刘 通,母国栋,3,李银龙,贺木易,杨敏莉,陆登俊,张 峰*

(1.广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；2.中国检验检疫科学研究院 食品安全研究所，北京 100176；3.北京工商大学 轻工科学技术学院，北京 100048)

真菌毒素是丝状真菌产生的一类有毒次级代谢产物，极易在农产品和饲料中产生污染，导致人类和动物发生严重的健康问题。当动物摄入被真菌毒素污染的饲料时，这些真菌毒素会被代谢成毒性更强的次级产物，并转移到动物产品(奶和肉等)中，进而增大人类摄入真菌毒素的风险。根据联合国粮农组织(FAO)的统计，世界上已有100多个国家制定了食品和饲料中真菌毒素的最大限量标准。我国2017版《GB 2761-2017食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中进一步降低了食品中黄曲霉毒素等常见真菌毒素的限量，除脱氧雪腐镰刀菌烯醇(1 000 μg/kg)外，其它毒素的最大检出含量均不得超过60 μg/kg。因此，需要开发精准的食品中真菌毒素分析方法实现有效监管。表1给出了中国、欧盟和美国对食品中常见真菌毒素的限量标准。

表1 食品中常见真菌毒素的致癌性归类及中国、欧盟(EU)和美国(US)对其在食品中的限制水平Table 1 Carcinogenicity classification of common mycotoxins in food and limits standards in China，EU and US for mycotoxins in food

近年来，应用于食品中真菌毒素的检测方法主要包括免疫分析法[1-2]、色谱法[3-4]和质谱法[5]等。其中，色谱法和质谱法可对食品中多种真菌毒素进行同时分析，具有检测线性范围宽和灵敏度高等优点，但对复杂食品中真菌毒素的检测仍然存在较多的困难[6]。真菌毒素在食品中的浓度水平较低，易与复杂的基质成分结合产生基质干扰，进而严重影响检测灵敏度[7]。因此检测前需要进行高效的样品前处理，以达到分离和富集目标物，消除基质干扰的目的。

目前，应用于食品中真菌毒素的样品前处理方法主要有液液萃取法(Liquid-liquid extraction,LLE)和固相萃取法(Solid phase extraction,SPE)[7-8]。LLE由于存在有机溶剂消耗量大、操作复杂以及易引入新的污染物等缺点，应用受到限制[7]。而SPE极大地简化了样品前处理步骤，并降低了有机溶剂的消耗，应用更为广泛[7-8]。传统的SPE主要是用C8、C18和苯基等有机基团键合二氧化硅等材料作为目标化合物的吸附材料，但这些材料存在重复使用率低、吸附容量少和稳定性差等缺陷。近年来，碳基纳米材料、生物材料和高分子聚合物材料的发展促进了SPE在样品前处理中的应用。这些新型SPE材料由于具有超小的尺寸、超大的比表面积、独特的结构和功能特性等优点，极大地提高了对复杂食品基质中痕量或超痕量目标物的分离和纯化能力[6]。尽管使用新型SPE材料从复杂样品中提取多种目标物(如酚类、多环芳烃和农药等)的相关综述已有很多[9-14]，但对SPE材料在食品中真菌毒素样品前处理方面的介绍还很少。为系统了解SPE材料在真菌毒素富集净化中的应用进展，本文对近5年来报道的新型SPE材料在食品中真菌毒素样品前处理中的应用进行了总结(表2)，对新型SPE材料的优缺点进行了比较(表3)，并对其未来的发展进行了展望。

表2 基于固相萃取材料的样品前处理技术在食品真菌毒素分析中的应用Table 2 Application of sample pretreatment technology based on solid phase extraction materials in the analysis of mycotoxins in food

表3 食品真菌毒素检测中不同固相萃取材料的对比Table 3 Comparison of different solid phase extraction materials before detection of mycotoxins in food

1 碳基纳米材料

1.1 多壁碳纳米管(Multi-wall carbon nanotubes,MWCNTs)

MWCNTs是由多层类石墨烯片卷曲而成的中空纳米材料，具有尺寸小(纳米级)、热和机械稳定性优异、疏水表面积大和易于被表面修饰等优点[13-17]。Dong等[18]将MWCNTs作为固相萃取填料用于玉米、小麦和大米中4种A型单端孢霉烯类真菌毒素的富集净化。在最优的SPE条件下，样品回收率为73.4%～114%，检出限(LODs)可达 0.01～0.03 μg/kg。该课题组为进一步提高富集效率和缩短前处理时间，采用聚合包裹机制，将磁性纳米颗粒(Fe3O4)与MWCNTs进行超声组装，制备的磁性多壁碳纳米管(Fe3O4@MWCNTs)可将萃取时间缩短至3 min[19]。此外，将特定的化学官能团(含氧基团等)修饰在MWCNTs的侧面或底部，不仅能提高材料的稳定性和亲水性，还可与目标物之间形成更多的相互作用，如氢键、离子交换作用等，增强其吸附能力和选择性[20-22]。Zhao等[23]将用胺封端的聚乙二醇(PEG)对Fe3O4@MWCNTs表面进行共价官能化修饰，成功制备了一种新型磁性纳米颗粒(Fe3O4@MWCNTs@PEG)。亲水基团(羟基)的引入增强了Fe3O4@MWCNTs的稳定性和亲水性，减少了材料的团聚现象。10 mg的Fe3O4@MWCNTs@PEG仅需3 min即可完成牛奶中13种真菌毒素的萃取(回收率81.8%～106%)，显著降低了吸附剂用量。Li等[16]以3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷作为中间连接体将聚乙烯亚胺(PEI)修饰在Fe3O4@MWCNTs上，制备了一种PEI改性的磁性多壁碳纳米管(Fe3O4@MWCNTs@PEI),用于10种不同极性真菌毒素的富集净化。PEI的引入使Fe3O4@MWCNTs表面含有丰富的羟基和氨基，这些基团提供了丰富的阴离子交换作用位点，增强了其对不同极性真菌毒素的提取能力。在最佳SPE条件下，样品回收率为88.3%～104%，最大吸附能力为4.9～10.2 mg/g。此外，Fe3O4@MWCNTs@PEI还具有较好的重复使用性，6次重复实验后提取效率无明显变化。

总之，MWCNTs由于具有制备简单、比表面积大和纳米级结构等优点，被认为是食品中真菌毒素的优良吸附剂。但MWCNTs也具有易于团聚，选择性和亲水性较差等缺陷，严重限制了该类材料的使用[24]。因此，有必要寻找合适的官能团对其进一步修饰，提高稳定性、选择性和亲水性。

1.2 氧化石墨烯与还原性氧化石墨烯

氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)是石墨烯通过氧化反应获得的产物，其表面丰富的含氧官能团(羧基、羟基和含氧基)使之具有较好的亲水性，并提高了对目标物的选择性和亲和力[25-26]。然而，单独的GO在SPE中易发生不可逆的团聚，影响实验结果的可靠性和重复性[26-27]，因此需要引入纳米颗粒或载体以防止GO团聚。Yu等[28]根据GO可通过静电相互作用轻松包裹在3-氨丙基硅胶上的原理，成功制备了GO包裹3-氨丙基硅胶的复合材料(SiO2@GO)，并用于谷物中黄曲霉毒素(AFs)的萃取。附着在SiO2颗粒表面的GO纳米片状结构显著提高了SiO2@GO的吸附能力，可在满足样品回收率的条件下(76.8%～107%)，将萃取时间缩短到10 min。Ma等[29]将GO涂覆在搅拌棒上用于豆浆中痕量AFs的高灵敏度检测，在最优萃取条件下，样品回收率为80.5%～102%，检出限(LODs)为2.4～8.0 pg/mL。此外，GO涂覆搅拌棒具有较好的稳定性，重复使用10次样品回收率无明显变化。

还原性氧化石墨烯(Reduced graphene oxide,rGO)是GO经还原反应去除部分官能团而获得的性质更稳定的一种新型石墨烯材料。rGO不仅保留了GO的部分含氧基团，而且具有更薄的厚度，这使得rGO具有较好的吸附性能[25,28]。Jiang等[27]将金纳米颗粒引入到rGO表面制备了一种新型SPE填料(rGO@Au)，并用于牛奶中AFs等9种真菌毒素的检测。对大多数真菌毒素而言，纳米颗粒会增加rGO的层间距并减少团聚，从可而极大地提高复合材料的吸附性能，经rGO/Au纯化的牛奶降低了基质效应(MEs:81.3%～102%),而α-玉米赤霉醇(78.0%)和β-玉米赤霉醇(68.1%)的基质效应仍不令人满意，因此应对这类材料进行进一步修饰，以提高其选择性。

类似于MWCNTs，GO和rGO由于具有制备简单、比表面积大和表面富含氧官能团等优点，被认为是食品中真菌毒素的优良吸附剂。但GO和rGO同样存在易于团聚和选择性较差等缺陷[28,30-31]。因此，需要进一步官能化修饰，以提高其稳定性和选择性，进而扩大两者在食品中真菌毒素样品前处理方面的应用范围。

2 生物材料

2.1 抗 体

抗体常被用作免疫亲和柱(Immunoaffinity column,IAC)填料应用于食品中真菌毒素的富集净化，对特定真菌毒素具有高特异性亲和力，因而可以较好地去除基质效应并实现较高的样品回收率[32-35]。AlFaris等[36]采用IAC对婴儿食品中的4种AFs进行富集和纯化，结合超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析，有效消除了干扰峰，获得了较高的样品回收率(92.0%～103%)和检测灵敏度(LODs:0.003～0.008 ng/mL)。Zhang等[35]通过杂交瘤技术制备了针对AFs、赭曲霉毒素A(OTA)、T-2毒素(T-2)和玉米赤霉烯酮(ZEA)的单克隆抗体，然后将其与溴化氰(CNBr)活化的琼脂凝胶4B进行偶联，制备了一种对多真菌毒素具有特异性的抗体，实现了农产品中7种真菌毒素的快速同时富集纯化，样品回收率高达98.8%～102%。

抗体在食品真菌毒素的富集纯化中展现出特异性强、选择性好和富集效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如价格昂贵、重复使用率低、易变性和降解等，严重限制了这种生物材料在SPE中的广泛应用。因此需要进一步的改进，以降低成本，提高重复使用性。Liao等[37]为提高IAC的重复使用性，将使用后的IAC通过磷酸盐缓冲液进行洗涤和保存，处理后的IAC可重复使用9次，且样品回收率保持在70%以上，显著降低了IAC的使用成本。Ren等[38]制备了一种抗独特型纳米抗体，通过噬菌体免疫聚合酶链反应(PD-IPCR)同时定量检测了谷物中的黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，降低了抗体制备的难度，并实现了食品中多种真菌毒素的同时高灵敏度分析，更具有成本效益。

2.2 适配体

适配体是长度范围为20～100个碱基的单链寡核苷酸。适配体的独特序列使其能够通过各种相互作用(包括堆积相互作用、氢键和范德华力等)与相应的目标物特异性结合，进而可用作分子识别生物材料[39]。此外，适配体还具有较好的亲水性和易于被修饰等优点。近年来，研究者通过将适配体构建在不同的载体上(纳米颗粒[40-41]和磁性材料等[42-44])，在食品中真菌毒素的样品前处理中获得了较好的应用。Xu等[41]制备了表面含有丰富硫醇基团的金纳米颗粒适配体杂化亲和材料，适配体覆盖密度高达3 636 pmol/μL，可实现对复杂样品中ZEA的高特异性在线富集分析(图1)，且重复使用30次，样品回收率均保持在90%以上。Khodadadi等[42]将适配体修饰在二氧化硅功能化的磁性Fe3O4表面，用于乳制品中黄曲霉毒素M1(AFM1)的富集净化，在获得较高样品回收率(97.0%～116%)的同时将萃取时间缩短至8 min。

图1 适配体基杂化亲和材料的制备(A)及其对ZEA的在线分析流程图(B)[41]Fig.1 Preparation of adaptor-based hybrid affinity material(A) and online analysis flow chart for ZEA(B)[41]

适配体在样品制备中展现了诸多优势和潜力，但仍存在一些限制条件[13,44]。首先，筛选对真菌毒素具有强亲和力的适配体具有一定的困难。传统的DNA库不能提供较多种类的适配体，而多轮聚合酶链式反应(PCR)扩增程序可能会导致结合序列的丢失。其次，对适配体进行表面修饰时可能会降低识别区域的结合特性。此外，由于适配体基于核酸，因此暴露于存在核酸酶的食品基质中可能会导致适配体中核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。因此，还需要开发新颖的制备方法来进一步提高适配体的稳定性和可重复使用性。

3 高分子聚合物材料

3.1 分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers,MIPs)

MIPs是通过分子印迹技术人工合成的对特定目标分子(模板分子)具有特异性识别和选择性吸附的聚合物。MIPs以其优异的化学和机械稳定性、对目标化合物的高特异性和良好的可重复使用性等，在食品中真菌毒素分析的样品前处理中展现出优势[45]。Rico-Yuste等[46]以4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酰胺作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，尿石素C作为交链孢酚替代模板，制备了对交链孢酚和链孢酚单甲醚具有特异性识别作用的分子印迹聚合物。这种材料不仅具有较高的样品回收率(67.0%～97.0%)，还具有优异的重复使用性(重复使用30次，吸附性能无明显变化)。同时，使用价格更为低廉的替代物作为伪模板分子不仅降低了制备成本，还可防止因模板渗漏造成的分析结果偏高。Huang等[47]以磁改性的埃洛石纳米管为载体制备了一种新型的磁性分子印迹复合材料(SPMIP)，用于谷物样品中ZEA的快速高效净化。SPMIP具有网状多孔结构，其孔径与ZEA分子相当。SPMIP表面丰富的氧原子可与ZEA上羟基的氢原子形成氢键，具有较高富集能力，最大吸附容量为13.473 5 mg/g。此外，磁性载体的引入，使SPMIP可以与基质溶液实现快速分离(100 s)，无需离心和过滤步骤，进而大大降低了样品前处理的复杂性，缩短了处理时间。本课题组[48]将分子印迹修饰技术引入固体基板电喷雾离子源中，首次合成了分子印迹聚合材料涂布的不锈钢片(MIPCS)，并研制出一种新型敞开式质谱离子源(MIPCS-ESI-MS)，实现了牛奶中5种氟喹诺酮类抗生素的灵敏、快速、准确检测(图2)。基于分子印迹技术和敞开式质谱技术，目前本课题组正在进行食品中真菌毒素高选择性快速检测方法的开发。

图2 MIPCS-ESI-MS分析流程图[48]Fig.2 Analysis flow chart of MIPCS-ESI-MS[48]

MIPs因具有制备简单、成本低、稳定性好和选择性高等优点，被认为是食品中真菌毒素的优异吸附剂。然而，MIPs在样品前处理中的应用也存在一定的不足之处。首先，目前制备的多数分子印迹聚合物亲水性较差，因此样品基质中的水可以与MIPs上的功能基团形成氢键，进而占据其识别位点[13,49]。其次，模板分子不能有效去除，从而会降低MIPs对分析物的吸附能力，并对分析结果的准确性和可靠性产生影响[50-52]。因此，需要通过选择合适的亲水性功能单体、交联剂和溶剂，制备能有效去除模板分子的亲水性MIPs，进而使MIPs在真菌毒素样品前处理中发挥更大作用。

3.2 金属有机框架材料(Metal organic frameworks,MOFs)

MOFs是由金属离子或簇与有机连接体组合而成的一种新型多孔晶体材料，具有化学结构和孔径可调控，比表面积大和易于表面修饰等优点，是近年来的研究热点[53]。合成MOFs的金属离子和有机配体种类繁多，使得MOFs在结构设计和合成上具有很大的灵活性，进而可以根据目标化合物的特性选择合成不同拓扑结构的MOFs，以增强其对目标化合物的选择性和吸附性能[53]。然而，由于某些MOFs中的配位键较弱造成其在极性溶剂(水)中的稳定性较差，骨架容易坍塌，因此在使用MOFs作为SPE吸附剂时，通常需要进行表面修饰，以增强其在基质溶液中的稳定性[53-54]。Liu等[55]成功合成了一种半胱氨酸(Cys)功能化的锆基MOFs(UiO-66-NH2@Au@Cys)，用于苹果汁中棒曲霉毒素(PAT)的富集纯化。Cys 的引入不仅提高了UiO-66-NH2的稳定性，而且提供了丰富的活性位点，包括氨基、羧基和羟基等，增强了吸附选择性和吸附效率，吸附容量比基于微生物的生物吸附剂高10倍。Li等[56]通过sonogashira偶联反应将微孔有机网络(MON)引入到Fe3O4@UiO-66-NH2表面，制备了磁性复合材料Fe3O4@UiO-66-NH2@MON并用于食品中AFs的磁固相萃取。10 mg的吸附材料仅需10 min即可达到最大吸附量(16.3～19.6 mg/g)，样品回收率为87.3%～102%。Liang等[57]以UIO-66-NH2作为表面接枝材料，槲皮素作为虚拟模板，丙烯酰胺作为共聚单体，制备了UIO-66-NH2@MIP吸附剂，用于食品中痕量AFs的富集净化。该材料兼具MOFs的高比表面积和MIPs的高特异性优点，对AFs的富集效率明显优于免疫亲和柱、硅胶SPE柱、C18SPE柱和Florisil SPE柱。

MOFs由于具有超大的比表面积和有序的多孔结构等优点，在食品中真菌毒素的富集净化中表现出广阔的应用前景。与裸MOFs相比，功能化的MOFs在食品真菌毒素富集净化中的稳定性和选择性得到显著提高。但对于MOFs和MOFs衍生材料仍需要解决一些问题，如稳定性低、制备成本高和选择性有限等。设计和合成具有热和化学稳定性好、选择性高和可重复使用次数多的新型MOFs和MOFs衍生材料用于食品中真菌毒素的富集净化，可能还需要更多努力。

3.3 多孔共价有机材料

多孔共价有机材料(Porous covalent organic materials,PCOMs)是一类由轻质元素(C、H、O、N等)通过强共价键链接而成的新型多孔有机聚合物材料，主要包括具有晶型结构的共价有机框架材料(Covalent organic framework materials,COFs)和无定型的共价有机聚合物等[10,14]。PCOMs由于具有密度低、比表面积大、吸附容量高、易于表面修饰以及结构可控和功能可调等优点，被认为是优异的SPE材料[10,14]。Wei等[58]以三[(4-甲酰苯氧基)甲基]乙烷和对苯二甲酰肼为单体制备了一种共价交联聚合物，并将其用于大豆及其制品中AFs的富集纯化。研究表明：制备的共价交联聚合物通过π-π堆积、立体效应和疏水相互作用实现了较好富集净化效果，样品回收率为76.1%～113%，方法的LODs为0.08～0.20 μg/kg。Gu等[59]将金纳米颗粒引入COFs表面后，又将MIPs修饰在金纳米颗粒上，构建了用于测定AFB1的石英晶体微天平传感器(QCM)(图3)。由于COFs具有较大的比表面积，因此在其表面形成了较多的MIPs识别位点，从而对AFB1具有较高的样品回收率(87.0%～102%)和检测灵敏度(LODs：2.8 pg/mL)。此外，目前本课题组也在研究磁性COFs对食品中ZEA及其衍生物的富集净化效果，并已证明其在牛奶和酸奶样品中具有较好回收率(81.0%～90.3%)。

图3 QCM的制备(A)及其对AFB1的检测流程图(B)[59]Fig.3 Preparation of QCM(A) and flow chart of AFB1 detection(B) [59]

相比于其它纳米材料，PCOMs具有一些独特的优势，如在酸性和碱性条件下具有较高的热和化学稳定性等[9-10,14]。但目前制备出的PCOMs及其杂化复合材料仍然具有一些缺陷，如有限的选择性和固有的疏水性等，限制了其在食品中真菌毒素富集净化方面的广泛应用。因此，仍然需要通过进一步研究来提高PCOMs及其杂化复合材料的选择性和多功能性。

4 总结与展望

真菌毒素及其代谢物在食品中广泛存在，不仅给人类带来了严重的健康风险，而且给农业产业造成了巨大的经济损失。因此，快速准确检测食品中真菌毒素及其代谢物的污染情况，显得尤为重要。一方面，食品中真菌毒素含量低；另一方面，真菌毒素易与食品基质成分结合，掩蔽性强，为食品中真菌毒素的快速精准分析带来了极大的挑战。为了应对上述挑战，吸附性强、选择性高、吸附速度快的新型固相萃取材料迅速发展，这些新型SPE材料对食品中真菌毒素的富集纯化显示出高效的潜力，但仍需要进一步改善。首先，要实现高效的样品固相萃取前处理，应开发功能化和可设计的新型吸附材料，提高其特异性和吸附能力。其次，可将几种新型固相萃取材料相结合，制备成具有多种优异性能的复合材料。例如，MIPs与MOFs或PCOMs结合形成具有强特异性和高吸附性的新型萃取材料。另外，为了增强SPE材料在复杂食品基质和实际操作中的可用性和耐用性，需要提高其稳定性和可重复使用性。总之，日益发展的SPE材料已在复杂食品基质中痕量真菌毒素的富集净化方面取得了重要研究进展，未来应针对性地设计制备稳定性更好、特异性更强和富集效率更高的SPE材料，以期在食品中痕量真菌毒素的快速、高效、精准检测中发挥更大的作用。