甲状腺乳头状癌的BMP8A表达及其与颈部淋巴结转移的相关性

曾学宇，陈 柱，毛 敏，陈之白，陈春雨，曹稳珑，李杰华

(广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科，广西南宁 530021)

甲状腺癌是人体内分泌系统中最为常见的恶性肿瘤，近年来发病率增长迅速，在我国年龄小于30岁的女性中，其发病率位居恶性肿瘤第一位。按照不同起源及分化差异，甲状腺癌又分为乳头状癌、滤泡癌、髓样癌和未分化癌，其中甲状腺乳头状癌(thyroid papillary carcinoma, PTC)是甲状腺癌中占比最高的病理类型。PTC的生物学行为较为温和，发展缓慢，恶性程度较低，患者总体生存率较高[1]，但仍有部分因素对患者的预后造成不良影响，其中合并颈部淋巴结转移(cervical lymph node metastasis, CLNM)的负面效应较为显著。此外，肿瘤术后复发均会导致患者预后变差，而CLNM在PTC的术后复发中有重要作用[2-5]。LIU等[2]研究显示，伴有CLNM的PTC患者比不伴有CLNM者的术后复发率显著增高(31.5%vs. 5.2%)。目前，合并CLNM的多数PTC患者术中均进行广泛颈侧区淋巴结清扫术(lateral neck dissection, LND)。CHINN等[6]认为对于较年轻的患者(<24岁)，往往需要接受多次LND才可达到理想的颈侧区复发控制率，而依据甲状腺癌诊疗指南[7]，多次手术会明显增加患者的喉头水肿、喉返神经损伤和术区出血压迫气管等并发症的发生概率，对患者预后不利；术后绝大部分PTC患者采用口服左旋甲状腺素钠片，降低血清中促甲状腺激素(TSH)水平的方法预防PTC的复发(即TSH抑制治疗)。然而，现阶段的相关研究尚未找到切实的证据证明TSH抑制治疗对PTC患者(尤其是伴有CLNM等高风险组PTC患者)具有可观的预防复发的效果[8]。因此，探究PTC发生颈部淋巴结转移的具体机制及影响因素，并寻求预防PTC术后复发的新方法，逐渐成为甲状腺癌领域研究的一个新热点。

骨形态发生蛋白8A(bone morphogenetic protein 8A, BMP8A)是骨形态发生蛋白(BMP)基因家族中的一员。BMP家族在胚胎发生、骨骼形成、造血和神经发生等过程中均发挥作用。有研究发现BMP8A的编码产物可能在生殖系统的发育中发挥作用[9]，除此之外目前与BMP8A相关的研究不多，也尚未明确BMP8A与PTC之间的相关性。本研究通过TCGA和GEO数据库分析并获得在 PTC中BMP8A表达差异较显著，进一步检测PTC与癌旁组织中BMP8A的mRNA及蛋白表达，并分析其表达与患者临床病理特征之间的关系，为探究针对有高复发风险的PTC患者术后治疗方案的制订提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库的数据收集和分析从TCGA的网站(https://cancergenome.nih.gov/)下载493例PTC组织和58例正常甲状腺组织的FPKM RNA-seq数据和与之匹配的临床资料；再根据从ENSEMBL数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)下载得到的GRCh38.98基因组文件，将ENSEMBL ID转换为基因符号，提取BMP8A表达的文件，用独立t检验确定PTC组织与正常甲状腺组织之间的差异表达。

从Gene Expression Omnibus(GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载GSE64912、GSE83520、GSE33630及GSE3678共4个表达谱，通过GEO query的R软件包验证结果，GSE64912包括18例原发性PTC和4例非肿瘤组织，GSE83520包括12例原发性PTC和12例非肿瘤组织，GSE33630包括49例原发性PTC和54例非肿瘤组织，GSE3678包括7例原发性PTC和7例非肿瘤组织，同样采用独立样本t检验分析BMP8A在PTC组织与正常甲状腺组织之间的表达差异。

1.2 患者临床信息及组织标本收集2019年4月至2019年10月期间，收集于广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科接受手术治疗的PTC患者标本及与其癌旁组织，共35例。纳入标准：患者病理结果证实为PTC；术前未行甲状腺放化疗或内分泌治疗；均行甲状腺癌根治术；临床病历及病理资料完整。

于术中收集35例患者切除的PTC组织及癌旁组织(距离肿瘤组织≥3 cm)，新鲜标本获取后分别放置于装有RNA保护剂的普通冻存管中，转入-80 ℃冰箱保存备用。

同时收集患者性别、年龄、肿瘤大小及有无颈部淋巴结转移等相关临床信息。

上述患者均知晓且已签署知情同意书，相关研究均经本院伦理委员会批准。

1.3 Real-time PCR检测PTC中BMP8A的mRNA表达用9767试剂盒分别提取PTC组织及其癌症组织的总RNA；RR036A试剂盒将总RNA逆转录为cDNA；使用RR820A试剂盒配制Real-time PCR体系、ABI 7500系统进行Real-time PCR反应，反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火34 s，共循环40次；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s结束，读取并记录每个样本的Ct值，计算并比较癌组织与癌旁组织ΔCt分析BMP8A的表达差异。反应体系的体积为20 μL，每个样本设置3个复孔。上述试剂盒均系TaKaRa公司产品，引物的设计与合成由南宁科迪生物技术有限公司提供，引物序列见表1。

表1 Real-time PCR中各基因的引物序列

1.4 Western blotting检测BMP8A蛋白的表达用含10 g/L PMSF的RIPA试剂提取总蛋白质，并使用BCA法测定浓度并依据所测蛋白浓度调整上样体积；SDS-PAGE(100 g/L分离胶和50 g/L浓缩胶)80 V、120 V恒压电泳；200 mA恒流1.5 h湿转法转膜至0.45 μm的PVDF膜上；使用含50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h，于兔抗人BMP8A(1∶800)和GAPDH(1∶1 000)4 ℃孵育过夜后，转至HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1∶5 000)的二抗溶液中室温孵育1 h，TBST洗涤后超敏ECL试剂显影。实验结果用ImageJ软件进行分析(上述试剂购于上海碧云天生物技术有限公司，所用抗体来自Immunoway公司，抗体编号分别为Q7Z5Y6和P04406)。

2 结 果

2.1TCGA数据库分析结果将TCGA数据库中的PTC数据经t检验分析发现，PTC组织中BMP8AmRNA较正常组织呈低表达(P<0.001，图1A)。同时在不伴有CLNM的PTC组织中，mRNA表达高于伴有CLNM组(P=0.046 5，图1B)。

图1 TCGA数据库中甲状腺癌组织或正常组织中BMP8A的mRNA相对表达

为进一步验证从TCGA数据分析所获得的结论真实性，分别将GEO数据库中的独立数据集GSE64912、GSE83520、GSE33630和GSE3678进行t检验和配对t检验分析，获得了与TCGA数据库分析一致的结果：BMP8AmRNA在PTC组织中相较于正常甲状腺组织为低表达(均P<0.05，图2)。因此，不同数据库之间的独立数据集分析得到相互验证。

图2 在不同GSE数据集中PTC组织及甲状腺正常组织的BMP8A mRNA相对表达

2.2 PTC及癌旁组织中BMP8A mRNA的表达Real-time PCR结果显示，BMP8A和β-actin的溶解曲线皆单峰，峰值温度分别为86.64 ℃和87.72 ℃，说明未产生引物二聚体，引物特异性良好。两者扩增曲线均可见明显平台期，Ct值波动幅度小，实验数据可靠。PTC组织中BMP8A的ΔCt(8.779±1.733)高于癌旁组织(6.829±1.688)，即BMP8A在PTC组织中呈低表达(P<0.001，图3)。

2.3 PTC中BMP8A的表达与患者临床病理特征的关系在不同患者PTC组织中BMP8A的ΔCt值与患者临床病理特征的统计分析结果显示，在PTC组织中BMP8A的表达与有无颈部淋巴结转移

图3 PTC组织与癌旁组织中BMP8A的ΔCt比较

2.4 PTC及癌旁组织中BMP8A的蛋白表达Western blotting结果显示，相较于癌旁组织，BMP8A蛋白在 PTC组织中呈低表达(t=-4.044,P=0.003)；同时，伴有颈部淋巴结转移的PTC组织(N1)BM8PA蛋白表达明显低于无颈部淋巴结转移的PTC组织(N0)(t=-9.623,P<0.001，图4)。

表2 BMP8A mRNA表达与 PTC患者临床病理特征的关系

图4 Western blotting检测BMP8A蛋白表达及统计学分析

3 讨 论

近年来，甲状腺癌的发病率不断增加，发病日益年轻化。PTC在甲状腺癌中占比最高，其疾病进程总体较缓慢，患者大都预后良好，10年生存率达93%，30年生存率可达76%，然而PTC的复发率不低，约20%的患者会面临行二次手术或多次手术的风险[10]。诸多回顾性分析都已阐明，CLNM对PTC的复发有显著影响[11-12]，而当前PTC的CLNM发生机制及其潜在影响因素尚未明确。LU等[13]曾通过整合生物信息学筛选出了数个与甲状腺癌相关的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，并预测这些DEGs可能通过细胞外基质受体的相互作用、PI3K-AKT信号通路和局灶性黏附等途径促进CLNM的发生。本研究亦通过对两个数据库(TCGA、GEO)进行分析，发掘出另一个与PTC相关的差异表达基因BMP8A。

BMP8A属于BMP家族，该基因家族可以编码TGF-β(转化生长因子-β)蛋白质超家族的分泌配体，这些配体与多种TGF-β受体结合，使SMAD基因家族的转录因子被募集和激活，从而调节机体的基因表达；该家族还是多能分子，可协调从早期胚胎和出生后发育到组织修复、再生和机体稳态等多种细胞功能。此外，BMP中不少成员也与肿瘤相关。LI等[14]研究显示，BMP4的上调使肝癌细胞迁移、侵袭和通道样结构形成的能力增强，促进上皮-间充质过程的转化和干细胞相关蛋白OCT4和SOX2的表达。此外，BMP4的过表达也能有效提高血管生成拟态相关蛋白的活性，最终增强肝细胞癌的血管侵袭性。SUN等[15]发现，BMP4可通过介导Smad1/5/9磷酸化和Smad4表达，引起SOX2的下调从而对多组胶质母细胞瘤的培养细胞发挥生长抑制作用。WANG等[16]发现，BMP2的高表达可能会激活AKT/mTOR通路，促进乳腺癌的微钙化灶形成，进而对靶向治疗或内分泌治疗产生抵抗力，预示不良预后。MIURA等[17]的实验表明，在胸腺上皮瘤中BMP7的高表达与预后不良密切相关，其可能成为胸腺上皮瘤的一个新的预后生物标志物。YU等[18]的研究提示，BMP8A可以通过促进Nrf2磷酸化及激活TRIM24而增强肾透明细胞癌的生存和耐药性。以上研究表明，BMP家族广泛参与肿瘤的发展进程，然而目前有关BMP家族与甲状腺癌的研究报道尚不多。

BMP8A作为BMP家族中的重要一员，依据NCBI(The National Center for Biotechnology Information)的数据，其在正常甲状腺组织中的表达显著高于其他器官组织。MATSUMOTO等[19]通过基因芯片筛选并证实了包括BMP8A在内的数个基因参与了T3型Graves病的发病。CHEN等[20-21]的研究表明，Graves病患者有较高的PTC发病风险，而PTC在伴有Graves病的患者群体中则表现出更高的侵袭转移能力。这提示BMP8A与PTC之间存在一定的关联性。而本研究首先通过生物信息学挖掘和分析，初步揭示BMP8A与PTC之间的相关性；为进一步验证结论，先后采用了Real-time PCR和Western blotting技术检测BMP8A的表达，结果显示，BMP8A在PTC组织中的表达显著低于癌旁组织，而伴有CLNM患者的PTC组织中BMP8A表达也明显低于不伴有CLNM患者，据此初步推断BMP8A可能是PTC的抑癌基因。但需要指出的是，LIU等[22]也开展了BMP8A与PTC的相关实验和研究，其结论与本研究相反，或许后续仍需要加大样本、重复试验加以验证。

综上所述，本研究认为BMP8A在PTC组织中存在显著的表达差异，相较于癌旁组织呈低表达，且其表达与颈部淋巴结转移情况有关，伴有颈部淋巴结转移组的表达降低更明显。这提示BMP8A的表达上调可能会对PTC细胞的增殖和淋巴结转移产生一定抑制作用。由于颈部淋巴结转移与PTC的术后复发密切相关，BMP8A有望成为一个新生物靶点，为PTC的诊断、治疗和预防复发提供新的方向。但本研究仍有不足之处，关于BMP8A在PTC细胞中的表达调控、作用通路等具体生物学机制尚待进一步研究。