基于高通量测序探索三伏贴对特禀质人群肠道微生物影响

周 洁，周帮旻，嘉士健，雷行华，寇潇月，陈丽妹，曾德军，袁菱梅，吴贤波

中医体质学以中医理论为基础，以分类提炼、快速评估健康信息的方法，对人群进行中医体质分类，并制定针对性的干预措施，以预防及治疗疾病。其中，由王琦[1]提出的9种体质学说应用最为广泛。特禀质为其中之一，该体质人群易患哮喘、鼻炎、荨麻疹等过敏性疾病，对外界环境适应能力差[2]。目前，从中医体质分类角度对特禀质的基础及临床研究较少，更多是从西医角度针对过敏性疾病的研究。

肠道微生物作为人体中最庞大的微生物群，对过敏反应起着至关重要的调节作用，也是目前研究过敏反应的重要方向[3-8]。因此，可用肠道微生物的变化作为突破口为特禀质人群的生理病理改变寻找生物学基础。目前，基因测序是获得肠道微生物信息最为流行的检测手段，尤其是高通量测序。为探索三伏贴对特禀质人群的的影响及其生物学基础，本研究基于高通量测序的方法，对受试者肠道微生物的16S rDNA的V3-V4可变区域进行扩增测序，比较三伏贴前后特禀质受试者肠道微生物变化，观察三伏贴对特禀质受试者肠道微生态的影响。

1 对象与方法

1.1 病例资料 研究对象均来自2018年成都市新都区中医医院门诊患者。研究通过成都市新都区中医医院伦理审查（2018-01）。纳入标准：年龄18～65周岁，性别不限；根据《中医体质分类与判定》标准判定体质，体质辨识结果为特禀质转化分≥40分则纳入试验组（特禀质人群），平和质转化分≥60分且其他8种体质转化分均＜30分纳入对照组（平和质人群，即健康人群）[9]；受试者签署知情同意书。排除标准：有急慢性肠道疾病，需长期或间断服用药物者；有严重原发性疾病长期服用药物者；近期1个月内未接受过抗生素及微生态制剂治疗；近3个月内参加过其他临床试验者。

根据研究方案招募20例受试者，其中试验组10例，对照组10例，其基本资料见表1，两组年龄、性别比较无统计学差异(P＞0.05)。试验中，特禀质受试者1例因怀孕脱落，平和质受试者1例因失访脱落、1例要求退出试验。试验过程中未发生不良事件。

表1 两组受试者基本资料比较

1.2 研究方法 采用自身对照的方法，对试验组连续两年贴敷三伏贴，对照组不接受任何干预。分别采集分析两组受试者2018年7月初伏前及2020年12月的清晨大便标本和中医体质得分。

1.3 三伏贴组方制备 组方为成都市新都区中医医院制剂室根据该院临床处方经验及文献自主配方，已在临床应用9年[10-11]。药物组成为延胡索、白芥子、甘遂、细辛等，按比例研成粉末，用新鲜姜汁调成膏状，制作成直径约1 cm、厚度约2 mm的药饼，用穴位贴敷固定贴固定在穴位上。

1.4 干预过程 （1）贴敷穴位：肺俞、脾俞、肾俞、膈腧（均为双侧）；（2）贴敷时间：2018、2019年农历“三伏”每伏的第1 d各贴1次，共6次，每次贴敷4 h；（3）观察反应：密切观察药物反应，记录并及时处理不良反应。

1.5 高通量测序过程及方法 使用无菌大便采集器采集受试者清晨大便标本约2 g，立即密封并放至干冰（-20°）中保存，送苏州金唯智生物科技有限公司进行基因测序、分析。提取粪便样本中细菌总DNA后，对16S rDNA V3-V4区进行扩增子测序，测序平台为Illumina MiSeq(Illumina,San Diego,CA,USA)，对测序后得到的原始序列片段进行拼接、去除嵌合体序列后得到有效序列，并在97%阈值的相似度上进行操作分类单元（OTU）分析、物种分类学分析（比对数据库为Silva_132 16S rRNA database），得到各个样本的肠道菌群的物种特征（包括物种名称、绝对丰度、相对丰度）。使用α多样性分析、β多样性分析描述肠道微生物的多样性特征，使用Metastats分析描述肠道微生物门水平和属水平的群落构成差异，使用LEfSe（LDA Effect Size）分析寻找起重要作用的特异性微生物类群（biomarker）[12-13]。

2 结果

2.1 体质得分比较 试验组贴敷两年三伏贴后，特禀质得分降低，平和质得分升高，特禀质相关症状得到改善（表2）。

表2 特禀质受试者两年前后体质转化分比较(−s)

表2 特禀质受试者两年前后体质转化分比较(−s)

注： 与2018年7月比较,①P ＜ 0.05

组别 取样时间 特禀质得分 平和质得分试验组2018年7月 53.18±9.85 60.76±16.18（n=9) 2020年12月 34.13±8.59� 72.92±6.99�

2.2 肠道微生物检测结果

2.2.1 测序质量 从稀疏曲线（图1）可以看出，当测序达到一定深度时，各个样本的稀疏曲线均趋于平缓，说明该研究的测序工作足够充分，测序质量可靠，每个样本的序列数量足以检测样本中存在的大多数物种。

图1 各样本稀疏曲线

2.2.2 α多样性分析 选择α多样性中的Simpson指数和Shannon指数对菌落物种组成的丰度及均匀度进行综合评价，干预前，两组受试者肠道微生物的Simpson指数和Shannon指数均无统计学差异（P＞0.05）。2020年对照2018年，两组受试者的Simpson指数和Shannon指数均无改变（P＞0.05）。尚不能认为三伏贴贴敷对特禀质受试者的肠道微生物的丰度及均匀度有影响。

2.2.3 β多样性分析 通过PCoA分析（图2）发现，两组受试者2018年各样本的坐标分布走向相似，说明两组的肠道微生物的多样性相似。两组受试者2020年样本的坐标分布走向相似，尚不能说明三伏贴能够影响特禀质人群的肠道微生物多样性。

图2 各样本的PCoA分析

2.2.4 肠道微生物群落结构及组间差异比较受试者的肠道微生物共检测出9个菌属：Bacter oidetes（拟杆菌属）、Firmicutes（厚壁菌属）、Proteob acteri a（变形菌属）等。2018年，两组受试者属水平群落结构无显著差异，优势菌属均为Bacter oidetes、Firmicutes，两个菌属总相对丰度占比＞90%。2020年两组受试者优势菌属不变，两个菌门总相对丰度占比均为89%。

在菌属水平上对两受试者2018肠道微生物进行组间比较差异无统计学意义。相对丰度＞0.01的菌属，2020年对照2018年，两组受试者的Bacter oides和Alistipes相对丰度均下降，Blautia相对丰度上升；试验组的Parabacteroides、Parasutterella相对丰度下降（对照组的Faecalibacterium相对丰度上升，Sutt erella相对丰度下降），见表3、4。

表3 试验组两年前后肠道微生物相对丰度＞0.01的菌属比较(−s)

表3 试验组两年前后肠道微生物相对丰度＞0.01的菌属比较(−s)

Taxon 2018年 2020年 P Alist ipes 0.0354±0.0113 0.004±0.0016 0.006 Bacteroides 0.4588±0.0849 0.0527±0.0249 0.001 Blautia 0.0141±0.0034 0.1051±0.0422 0.010 Parabacteroides 0.0175±0.0069 0.0015±0.0006 0.007 Parasutter ella 0.0106±0.0036 0.0005±0.0003 0.007

表4 对照组两年前后肠道微生物相对丰度＞0.01的菌属比较(−s)

表4 对照组两年前后肠道微生物相对丰度＞0.01的菌属比较(−s)

Taxon 2018年 2020年 P Alistipes 0.0374±0.012 0.0050±0.0027 0.011 Bacteroi des 0.3649±0.0787 0.0546±0.0249 0.003 Blautia 0.0160±0.0048 0.0918±0.0339 0.011 Faecalibacterium 0.0610±0.0171 0.1434±0.0302 0.024 Sutterella 0.0101±0.005 0.0002±0.0002 0.023

2.2.5 LEfSE分析 图3为受试者两年前后肠道微生物基于LeFse分析的物种聚类进化树图。其中，黄色节点表示在各组中均未起到重要作用的微生物类群，其他颜色圆点表示在该着色组别中起到重要作用的微生物类群（biomarker）。2018年，实验组在厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Proteobacter ia）均有b iomarker，而对照组没有。2020年，两组受试者在属水平上的biomarker不同，试验组为Blautia、Sellimonas、But yrici coccus、Rumi nococcacesa_UCG、Subdoligranoul um，对照组为Parvimonas、Ambiguous_taxa、Tyzzer alla_3。

图3 基于LeFse分析的物种聚类进化树

3 讨论

3.1 特禀质和平和质受试者的肠道微生物多样性比较无显著差异，biomarker有显著差异 本研究发现，特禀质和平和质受试者的肠道微生物多样性（α多样性和β多样性）无显著差异，且各个菌属、菌属的群落结构也没有差异。但LeFSEf分析发现，特禀质受试者在厚壁菌属（Firmicutes）和放线菌属（Proteobacteria）均有biomarker，平和质受试者没有。既往研究表明，过敏性疾病患者的肠道微生物多样性与健康人无显著差异，但菌属的相对丰度有显著差异[1，5-6]。同样是过敏疾病患者，研究结果不同，这是因为多数针对过敏疾病的研究均是在受试对象正在发生过敏反应的急性期进行，而特禀质是一种非稳态的体质，它代表的是一种既往发生过过敏反应或有过敏倾向的状态，更多地描述的是一种患病倾向而非病理过程，在参与研究的过程中，不一定处于过敏反应急性期。既往研究提示不同体质的人群其肠道微生物具有特异性表现，如阳虚质、痰湿质人群与平和质人群对比，其肠道微生物均有各自的特征，主要表现为群落结构的不同[14-17]。而研究发现，特禀质受试者与平和质受试者肠道微生物的群落结构相同，但biomarker生物标记不同。

3.2 三伏贴可以改善特禀质受试者的健康状态，可能与调节肠道微生物有关 三伏贴可以改善特禀质受试者的健康状态，降低其特禀质得分，提高其平和质得分，其疗效可能与调节肠道微生物有关。特禀质受试者经过两年三伏贴干预后，肠道微生物α多样性无改变，其肠道微生物β多样性的变化趋势与平和质组两年前后的变化趋势一致，三伏贴不影响特禀质受试者的肠道微生物多样性。在肠道微生物属水平群落结构方面，特禀质受试的变化与平和质受试者不同，三伏贴影响了特禀质受试者肠道微生物属水平的群落结构。此外，LEfSE分析结果发现三伏贴干预特禀质受试者后，其肠道微生物中的biomark er发生改变，且与平和质受试者不同。该研究通过高通量测序分析三伏贴干预两年后特禀质受试者的肠道微生物变化后，尚未发现肠道微生物的多样性有变化，但其属水平的群落结构及biomarker有变化。三伏贴改善特禀质受试者体质状态，可能与其肠道微生物属水平群落结构及biomarker有关。