ADSC外泌体通过MT1抑制矽肺炎症进展的实验研究

赵 锋，刘 翔，李少民，刘 倩，刘丽娟，任晓英，李建忠

矽肺是我国高发病率和高病死率的职业病之一[1]，中老年患者是最主要的发病群体[2]。染尘巨噬细胞的炎症反应与矽肺的发生和进展密切相关，探索抑制矽肺染尘巨噬细胞炎症反应的方案及其具体机制具有重要意义。近年来，脂肪干细胞(ADSC)外泌体抑制巨噬细胞炎症反应的作用及其机制研究已经成为研究热点[3-4]。ADSC外泌体作为ADSC治疗的新兴工具，具有与ADSC相似的生物活性物质[5]。前期实验结果显示金属硫蛋白Ⅰ(metallothioneinⅠ,MT1)在老年供体来源ADSC外泌体中较骨髓间充质干细胞(BMSC)外泌体中高表达。通过回顾文献，证实MT1属于金属硫蛋白亚型，在炎症反应中可抑制NF-κB信号激活[6-7]，进而抑制炎症反应的发生、发展。本课题拟在前期工作基础上，以MT1调控为切入点，探讨老年供体来源ADSC外泌体抑制矽肺染尘巨噬细胞炎症反应的作用及其具体机制，为矽肺治疗提供思路和依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备 实验中的主要设备有：恒温振荡器（上海精密仪器公司）；台式离心机（美国Beckman公司）；超净工作台（日本Ck-2公司）；流式细胞仪（美国Beckman公司）;细胞冻存盒（美国Nalgene公司）；酶标仪（美国BioTek公司）等。

纯度高于99%的SiO2购买自美国Simga公司（99%颗粒直径≤5μm）；1640培养液购自美国Gibco公司；青霉素和链霉素来自碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、双荧光素酶报告基因试剂盒、DAPI、Cy3及FITC染料均购自碧云天生物技术有限公司等。

1.2 实验动物及饲养 健康的老年SPF级C57BL/6小鼠，12～14月龄，由西安交通大学实验动物中心提供。研究涉及的所有动物实验均获得西安交通大学动物伦理委员会的审核批准。

1.3 模型制备与分组 用含10%新生小牛血清和青链霉素双抗的RPMI1640培养液调成细胞密度1×109AM/L的RAW264.7小鼠巨噬细胞悬液。将接种好的6孔板中分别加入一定量的粉尘溶液(SiO2粉尘悬液),用无血清的RPMI1640培养液调节为下列浓度:0、6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L，将其诱导为染尘巨噬细胞[8]。

1.4 分离和培养ADSC和BMSC 健康的老年C57BL/6小鼠（21～24月龄）处死后，消毒，取附睾周边脂肪组织，用眼科剪小心剔除血管及结缔组织，剪碎后加入等体积2%Ⅰ型胶原酶，37℃孵育，10 min震荡1次。筛网（100目）过滤组织，1200 r/min离心5 min，含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基重悬，接种。处死健康的老年C57BL/6小鼠（21～24月龄），取双下肢骨髓，离心后将10 ml预先冷却的PBS重新悬浮制备细胞混匀液。2 ml 10%FBS培养基重悬细胞后接种于小皿中，置于37℃，5%CO2培养箱内进行培养。

1.5 建立MT1功能过表达/缺失ADSC模型 为研究MT1的功能，利用慢病毒介导的基因过表达/shRNA载体感染ADSC[9]，建立MT1蛋白过表达和功能缺失的ADSC，利用Western blot检测是否构建成功。

1.6 SiO2粉尘刺激巨噬细胞形成染尘巨噬细胞将1×106RAW264.7小鼠巨噬细胞接种于25 cm2培养瓶中，加入SiO2悬液，配置成SiO2浓度为100μg/ml，加入到巨噬细胞培养液中培养24 h，将其诱导为染尘巨噬细胞[8]。

1.7 免疫共沉淀检测MT1蛋白与磷酸化NIK蛋白存在相互作用 取MT1过表达/shRNA载体感染ADSC和BMSC无血清的细胞培养上清液。提取染尘巨噬细胞总蛋白，SDS-PAGE上样进行电泳，用半干转印仪进行转膜，按1∶1000的比例稀释IgG抗体、MT1抗体、NIK抗体，4℃过夜后加入1∶3000稀释的二抗，室温孵育1 h后，进行显色。

1.8 检测NF-κB p52、NIK和IKKα蛋白磷酸化水平 取5×106个染尘巨噬细胞，PBS洗3次，提取细胞蛋白，调整浓度后蛋白上样，检测检测磷酸化IKKα、磷酸化NF-kBp50、磷酸化NF-kBp52、磷酸化NIK、磷酸化NF-kBp65、磷酸化NF-kBp100、和RelB的蛋白表达，结果扫描并定量分析，以βactin为内参。

1.9 ELISA检测染尘巨噬细胞炎症因子的分泌收集染尘巨噬细胞24h上清液，根据IL-1β、IL-6及TNF-αELISA试剂盒的要求，将捕获抗体、检测抗体及标准品稀释至储存浓度。依照说明书，稀释标准品，每孔加入100μl不同浓度的标准品或者待测培养上清。PBS冲洗后，加入辣根过氧化物酶后孵育20 min，显色后避光孵育20 min，使用酶标仪在450 nm处读数，计算出相应细胞因子浓度。

1.10 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，实验结果为计量资料，用均数±标准差表示，同时间点多组别间的测量值比较采用单因素方差分析（AN OVA），当差异有统计学意义，采用SNK法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADSC_MT1过表达和ADSC_MT1 shRNA慢病毒转染影响外泌体中MT1蛋白表达 对ADSC_MT1过表达和ADSC_MT1 shRNA组ADSC转染48 h后，根据倒置荧光显微镜下观察，ADSC可见明显的绿色荧光，证明慢病毒转染成功。为了研究转染效果，以β-actin作为内参，通过Western blot实验检测转染后MT1的蛋白表达水平，发现ADSC_MT1 shRNA组的MT1蛋白表达水平较ADSC_MT1过表达组降低。见图1。

图1 ADSC_MT1过表达和ADSC_MT1 shRNA慢病毒转染效果

2.2 ADSC外泌体中MT1蛋白与染尘巨噬细胞中磷酸化NIK蛋白存在相互作用 将MT1与磷酸化NIK进行免疫共沉淀，分析结果显示MT1处有明显的差异条带，说明用免疫共沉淀方法证实MT1与磷酸化NIK存在相互作用。通过Western blot实验检SiO2组NF-kBp50和NF-kBp52的蛋白表达水平，表明ADSC_MT1过表达组的NF-kBp50和NFkBp52蛋白表达水平较SiO2组过表达组降低。见图2。

图2 MT1与磷酸化NIK存在相互作用

2.3 MT1抑制NF-κB p52、NIK和IKKα蛋白表达水平 ADSC过表达组较其他组更显著抑制了NF-κB p52、NIK和IKKα磷酸化蛋白水平的表达。ADSC-shRNA组对NF-κB p52、NIK和IKKα磷酸化蛋白水平抑制最弱。见图3。

2.4 ELISA检测染尘巨噬细胞培养液中炎症因子分泌 ELISA结果显示MT1过表达显著抑制了染尘巨噬细胞细IL-1β、IL-6及TNF-α分泌量。巨噬细胞经过SiO2组激后，明显增加了TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量。同时分别加入ADSC_MT1过表达组较ADSC-shRNA组相比，明显降低了TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量。见图4。

图4 ELISA检测IL-1β、IL-6及TNF-α分泌

3 讨论

矽肺是我国最常见的一种职业病，严重危害患者的健康。研究已经证实，粉尘致肺泡巨噬细胞炎症反应是矽肺形成的一个重要环节[1-2]。 当粉尘进入机体后，肺泡巨噬细胞聚集到损伤组织周围并激活NF-κB信号通路，该通路的激活导致巨噬细胞、T细胞及相关因子聚集，加速肺部炎症和纤维化反应[3]。虽然经过医务工作者和研究人员的不断努力，但临床上尚未找到有效的矽肺治疗方法。自身来源的间充质干细胞因无伦理限制、抗炎、易于分离和培养等优点[4]，已成为矽肺治疗的研究热点。BMSC因无免疫原性和无伦理争议等，是目前研究最多的干细胞。然而，在临床中发现骨髓含量随着衰老迅速减少。但老年患者脂肪来源丰富，可以从皮下脂肪组织中大量获取。流行病学研究发现矽肺患者群体中，以中老年患者居多，因此对于大部分矽肺患者而言，ADSC较BMSC来源丰富。最新文献和前期研究同样发现，而且老年患者来源ADSC具有更显著的抗凋亡能力[5,10]。

既往研究和前期结果发现，ADSC和BMSC移植可通过抗炎反应抑制矽肺的发生、发展，对矽肺有着积极的治疗作用[4,11]，而且ADSC较BMSC更显著的降低了炎症反应[6-7,12-14]。外泌体是一种亚细胞结构信息复合体，含有各种与来源细胞相似蛋白、RNA、micRNA及siRNA等生物活性物质[15]，现广泛用于科学研究[16]。研究证实ADSC外泌体可抑制巨噬细胞炎症反应[17-18]。MT1属于金属硫蛋白亚型，MT1可通过抑制NF-κB信号激活[19-20]。然而，MT1抑制NF-κB信号的机制存在争议。既往研究发现NIK主要通过经典通路和非经典通路激活NF-κB[21]。

本研究为进一步研究ADSC与BMSC外泌体中MT1对染尘巨噬细胞的作用，前期成功构建了MTI过表达和MTI敲减的ADSC，通过Western blot证实转染影响了ADSC外泌体中MTI蛋白表达水平（图1）。将MT1与磷酸化NIK进行免疫共沉淀，Western blot结果显示MT1与NIK存在相互作用，提示ADSC外泌体中的MT1可能通过NIK发挥抗炎作用（图2）。为进一步明确MT1通过NIK激活NF-κB的具体机制，将添加了ADSC外泌体培养的染尘巨噬细胞行Western blot检测磷酸化NF-κBp50和磷酸化NF-κBp52蛋白水平，结果显示ADSC外泌体更显著抑制了NF-κBp52蛋白磷酸化水平，提示ADSC外泌体中MT1可能主要通过非经典通路发挥抗炎作用。研究证实，NF-κB诱导激酶(nuclear factor κB-inducing kinase,NIK)是NF-κB经典信号通路和非经典信号通路的共同上游激酶，对促进NF-κB的激活至关重要，既可 以通过NIK/IKKα(inhibitor kappa B kinase-α)/IKKβ经典通路激活NF-κB(p50/p65)，也可以通过NIK/IKKα/P100非经典通路激活NF-κB2(p52/RelB)。本研究通过Western blot检测添加了ADSC外泌体培养的染尘巨噬细胞磷酸化NIK、磷酸化IKKα和磷酸化NF-κBp52炎症蛋白水平，结果显示MT1过表达显著抑制了非经典通路中蛋白表达，表明ADSC外泌体中MT1通过NF-κB经非经典信号通路NIK/IKKα/P100抑制染尘巨噬细胞炎性进展。此外，ELISA检测结果显示，外泌体中MT1蛋白表达越高，染尘巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α越低，提示ADSC外泌体中MT1抑制了染尘巨噬细胞IL-1β、IL-6及TNF-α分泌。

综上所述，本研究提出科学假设：老年供体来源ADSC外泌体具有抑制矽肺炎症反应的作用，可能主要通过MT1抑制染尘巨噬细胞中非经典通路NIK/IKKα/P100介导的NF-κB2(p52/RelB)激活发挥抗炎作用。