向日葵籽仁脂肪和脂肪酸含量近红外光谱模型的建立

周 菲 王文军 刘 岩 马 军 王 静 吴立仁 关洪江 黄绪堂

（1黑龙江省农业科学院博士后科研工作站，150086，黑龙江哈尔滨；2黑龙江省农业科学院经济作物研究所，150086，黑龙江哈尔滨）

向日葵（HelianthusannuusL.）是世界上最重要的油料作物之一。向日葵具有耐盐碱、耐瘠薄和抗干旱等适应性强的特性，近年来，向日葵生产发展很快，现已成为仅次于大豆、油菜和花生的第四大油料作物[1]。我国栽培向日葵已有近400年的历史[2]，2018年全国向日葵年栽种面积92.135万hm2，总产量249.42万t[3]，主要集中在东北、华北及西北“三北”地区。向日葵油是一种营养价值很高的食用油，向日葵种子脂肪含量很高，不饱和脂肪酸含量比大豆和花生等主要油料作物高，其中亚油酸含量为69%左右，为胡麻的4倍、油菜籽的3倍、花生的2倍以及大豆的1.8倍[4]。

油料作物种子脂肪含量影响食用油的产量，而脂肪酸组成决定了食用油的品质，因此研发精确、快速和无损检测脂肪和各种脂肪酸含量的方法对于向日葵品质育种十分重要。目前测定种子脂肪和各脂肪酸含量的方法有索氏抽提法和气相色谱法，化学方法虽然精确度较高，但存在测定之前需要甲酯化，预处理过程繁琐，长链碳的酯较难气化等问题[5]，且待测的籽粒样品要粉碎，无法再产生后代，不利于育种材料筛选。近红外光谱（nearinfrared reflectance spectroscopy，NIRS）技术是利用有机化学物质内包含的各类含氢基团（CH、OH、NH和SH等）在近红外光谱区差异特征的吸收光谱，是快速检测样品成分含量的一项技术[6]。对于NIRS这种方法，建立高质量的数据模型是确保检测结果准确的必要条件。相比于传统的检测方法，NIRS方法具有分析快速、操作简便、可多组分同时测定、籽实能在无污染和无损伤条件下进行分析等优点，保证种子能正常繁殖接代，目前已广泛应用于油菜、大豆、花生和亚麻等油料作物[7]。

本研究选取50份具有代表性的油用向日葵材料，构建定量分析向日葵籽仁脂肪和4种主要脂肪酸含量的近红外光谱模型，可快速无损检测油用向日葵种子的品质，对于油用向日葵种质资源快速筛选以及品质育种具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2016年在黑龙江省农业科学院经济作物研究所种质资源库根据种子粒型和来源等，选取50份差异较大且具有代表性的油用向日葵材料，其中包括本单位选育的材料及国内外引进的资源（包括保持系、恢复系、杂交种和常规种）。

1.2 试验方法

1.2.1 光谱采集 利用瑞典波通（Perten）公司型号为DA7200的二极管阵列近红外光谱仪，首先设置仪器工作参数，谱区扫描范围是950～1650nm，采样间隔为1nm，扫描次数是32，SPC文件分辨率是5nm。利用Simplicity TM软件采集光谱，利用The Unscrambler 9.8软件进行数据分析和模型构建。对向日葵种子进行脱壳处理，仪器提前预热30min，每个样品扫描3次，重复装样3次，取平均光谱，保存后待分析。

1.2.2 脂肪和脂肪酸含量的测定 脂肪和主要脂肪酸（亚油酸、油酸、硬脂酸和棕榈酸）含量的测定委托农业部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）完成，将烘干后的样品粉碎至粉末后，采用索氏提取法测定脂肪含量（干基），检测方法按照NY/T 4-1982；利用气相色谱仪YLSB076测定脂肪酸含量，检测方法按照GB/T 17376-2008，每个样品重复测定3次，最后取平均值为样品成分含量的标准值。

1.2.3 近红外光谱模型的建立 采用偏最小二乘法（partial least squares，PLS）进行模型的构建。为消除背景噪声影响，使用各种光谱预处理方法优化模型，包括多元信号矫正（MSC）、标准正则变换（SNV）、一阶导数（1st）以及多种方法结合。模型的预测精度和稳健性采用校正相关系数R2、预测相关系数R2、校正均方根误差（RMSEC）和预测均方根误差（RMSEP）这4个参数来评价。

2 结果与分析

2.1 脂肪和脂肪酸含量差异分析

由50份油用向日葵籽仁脂肪和4种脂肪酸含量结果（表1）可以看出，脂肪、亚油酸和油酸含量的标准差均≥4.31，标准差较大，表明用于建模的样品这几种成分含量分布合理，范围较大，样品具有代表性。硬脂酸和棕榈酸含量的标准差分别为0.85和0.49，其标准差偏低，可能是由于向日葵籽仁自身硬脂酸和棕榈酸含量较低，导致样本间差异较小。

表1 向日葵籽仁脂肪和脂肪酸化学测定值的统计分析Table 1 Statistical analysis of fat and fatty acids by chemical determination in sunflower seed kernels

2.2 近红外光谱分析

对50份向日葵籽仁样品进行光谱采集，得到各样品的原始光谱图（图1），各样品吸光度均在0.5以下，不同波长下各样品近红外光谱的波峰、波谷和走势相似，说明各样品成分较为相似，油用向日葵种子中含有较多脂肪和蛋白质等有机物质。相同波长下样品间的吸光度不完全重合，表明向日葵籽仁样品间各组分含量具有差异性。

图1 向日葵籽仁原始近红外光谱Fig.1 Original near-infrared spectroscopy of sunflower seed kernels

2.3 光谱模型的建立与分析

为减小向日葵籽仁样品不均匀产生的影响，消除光谱信号中的基线漂移、光散射和背景这些干扰信息及噪声，提高模型的稳健度，利用一阶导数（1st）、标准正则变换（SNV）、一阶导数结合标准正则变换（1st+SNV）以及多元信号矫正结合一阶导数（MSC+1st）4种光谱处理方式，对原始光谱进行处理，比较并筛选向日葵籽仁各组分模型的最优光谱处理方法。图2为4种方法处理后的光谱，修正了光谱峰的偏移和漂移，光谱更紧密，轮廓更清晰。

图2 4种方法预处理后的光谱Fig.2 Spectrum after pretreatment by four methods

定量模型的校正和预测相关系数R2越高，校正和预测均方根误差（RMSEC和RMSEP）值越低，表明模型预测精准度越好。从不同光谱预处理方法所建近红外模型的参数（表2）可以看出，经MSC+1st处理后的脂肪含量模型为最佳模型，校正和验证相关系数R2分别为0.98和0.97，RMSEC和RMSEP分别为0.70和0.88；经MSC+1st处理后的亚油酸含量模型为最佳模型，校正和验证相关系数R2分别为0.98和0.97，RMSEC和RMSEP分别为0.49和0.71；经过1st+SNV处理后的油酸含量模型为最佳模型，校正和验证相关系数R2分别为0.98和 0.96，RMSEC和RMSEP分别为0.68和0.99；经过1st处理后的硬脂酸含量模型为最佳模型，校正和验证相关系数R2分别为0.92和0.83，RMSEC和RMSEP分别为0.25和0.37；经过SNV处理后的棕榈酸含量模型为最佳模型，校正和验证相关系数R2分别为0.82和0.74，RMSEC和RMSEP分别为0.18和0.23。上述结果显示脂肪、亚油酸和油酸所建最佳模型相关系数均大于0.96，且具有较低的均方根误差，说明籽仁脂肪、亚油酸和油酸含量与近红外光谱具有极强的相关性，而硬脂酸和棕榈酸所建最佳模型相关系数相对较低，但也均大于0.74（图 3）。

表2 不同预处理方法的籽仁脂肪及4种主要脂肪酸含量模型结果Table 2 Results of the models of fat content and four main fatty acids of seed kernels by using different pretreatment methods

图3 向日葵籽仁脂肪和4种脂肪酸含量最佳模型校正（左）和预测（右）相关图Fig.3 Correlation diagrams of calibration (left) and prediction (right) for the optimum model of fat and four fatty acids in sunflower seed kernels

2.4 近红外模型的验证

随机选取10份未参与建模的油用向日葵材料，利用相同方法对籽仁脂肪和脂肪酸含量进行测定，并利用所建模型进行成分含量的预测，通过比较样本的化学值和近红外预测值（表3），结果发现，脂肪、亚油酸和油酸近红外预测值与化学值之间相对误差在1.25%～8.15%之间，均在10%以下，表明模型预测准确度较高，能够满足样品成分含量的快速测定，硬脂酸和棕榈酸近红外预测值与化学值之间相对误差在4.66%～17.99%之间，可用于样品成分含量的初步预测。

表3 10份材料化学值与近红外预测值比较Table 3 Comparison of the chemical values and the predicted values of near-infrared of ten materials %

3 讨论

构建模型所用样品的成分含量范围决定了模型适应性，成分含量范围必须要尽可能广泛，才可以保证未来利用模型测定样品的数值不会发生异常或出现较大偏差[8]，本研究构建的硬脂酸和棕榈酸的模型相关系数偏低，可能是由于向日葵种子中本身这2种成分含量较低，且变异幅度小，致使建模挑选样品的代表性不够好，同时由于其含量低，在利用化学方法测定中容易造成误差，导致化学值准确性低，进而影响了模型的质量[9]。向日葵种子脂肪酸组成除品种之间差异外，还受到多种因素的影响，如温度[10-11]、土壤含盐量[12]、播种期和播种密度[13]，本研究中硬脂酸和棕榈酸含量分布范围较小，除由于材料自身特性外，也可能是由于环境因素影响所导致。本研究没有将脂肪和脂肪酸含量表现为极值的向日葵材料作为建模样品，主要因为这种类型样品量太少，与其他样品之间成分差异太大，只有积累较多此类样品后才能加入到定标集中，未来我们将通过增加样品的数量从而扩大样品的变异幅度，对其进行进一步的优化及完善。

不同光谱预处理方法会影响近红外分析模型的精准度，所以选择最佳的预处理方法十分重要。一般使用的光谱预处理方法包括SNV、MSC、1st、二阶导数和标准化处理法（normalization）等以及各种预处理方法的组合[14]。单粒花生种子近红外模型建立发现一阶导数结合多元信号矫正是棕榈酸和亚油酸光谱的最优预处理方法，一阶导数结合矢量归一化是油酸光谱的最优预处理方法[15]。茶油脂肪酸组分近红外模型构建发现油酸和α-亚麻酸采用SNV预处理，十七烷酸和硬脂酸采用SNV和1st预处理，棕榈酸和不饱和脂肪酸采用1st和趋近归一化（normalization by closure）预处理所构建模型较好[16]。油用牡丹种仁脂肪酸近红外模型建立发现，油酸最优光谱预处理方法是SNV+1st，亚油酸是MSC+1st，亚麻酸是MSC，棕榈酸是SNV[17]，这与本研究中油酸、亚油酸和棕榈酸最佳光谱预处理方法是一致的。

NIRS在向日葵中的研究很早就有报道。我们之前分别对向日葵完整种子、籽仁和粉末构建向日葵粗蛋白含量的近红外光谱模型，发现相比于完整种子，籽仁和粉末模型预测的精确度更高[18]，因此为保证操作简便和结果准确，本研究选择了脱壳后的籽仁进行模型构建。关于向日葵脂肪酸含量近红外模型的研究已有一些报道，Sato等[19]发现NIRS定量分析的准确性较高，利用向日葵籽仁建立的脂肪酸近红外模型相关系数R2达到0.993。Velasco等[20]建立了向日葵籽仁可靠的脂肪酸测定模型，采用交叉验证评估硬脂酸、油酸和亚油酸建模效果，R2在0.83～0.93之间，这个研究实现了向日葵籽仁脂肪酸含量的无损单粒检测。Fassio等[21]构建向日葵种子水分、脂肪和蛋白NIRS模型，其R2在0.90～0.96之间。Pérez-Vich等[22]构建向日葵完整种子、籽仁、粉末和葵花油的NIRS模型，其中籽仁、粉末和葵花油预测结果较好，籽仁模型R2在0.90～0.97之间。汪磊等[23]建立向日葵籽仁粗蛋白、粗脂肪、油酸和亚油酸等重要品质性状的近红外模型，其R2在0.913～0.975之间。本研究利用最佳光谱预处理方法构建的脂肪、亚油酸和油酸含量的近红外模型相关系数R2在0.96～0.98之间，相比于前人的研究，该模型的相关系数较高，说明模型具有较好的预测能力。尽管研究者已经构建了一些向日葵品质预测的近红外模型，但近红外技术模型在不同作物、不同设备及同一设备不同环境下，都不具有通用性[23]，而且模型的应用性还与建模样品生长气候、生长条件和收获季节等有关[8]，因此，本研究构建的NIRS模型，更适用于本地区气候条件下进行油用向日葵种质资源品质鉴定和快速筛选，可加快品质育种进程。

4 结论

采用无处理及4种光谱预处理方法构建向日葵种子脂肪及4种脂肪酸含量的近红外模型，其中近红外扫描光谱与脂肪、亚油酸和油酸含量化学测定结果的相关性较高，采用最佳光谱预处理方法，校正和验证相关系数都大于0.96，且RMSEC和RMSEP都较低，近红外预测值与化学值间相对误差均在10%以下，能够满足样品成分含量的快速测定。而硬脂酸和棕榈酸模型近红外扫描光谱与化学测定结果的相关性相对偏低，校正相关系数分别为0.92和0.82，验证相关系数分别为0.83和0.74，但RMSEC和RMSEP值均较低，近红外预测值与化学值间相对误差在4.66%～17.99%之间，可用于样品成分的初步预测。