基于病证结合探讨虎杖对湿热型高脂血症模型大鼠的作用*

段红福，连红兵，张文峰

1.郑州市中医院，河南 郑州 450007； 2.云南省第二人民医院，云南 昆明 650021； 3.仲景宛西制药股份有限公司，河南 郑州 450000

高脂血症是动脉硬化最重要的危险因素，严重威胁着人们的健康。符合中医特点的动物模型是高脂血症证型和药效研究的基础，但现有高脂血症模型[1-2]大多采用高脂饲料喂养的单一造模方法，不能体现中医证候因素[3]，不符合中医认知疾病和药物的特点。由于种族的差异，中国患者服用的他汀类药物不良反应的发生率明显高于欧洲人群[4]。而病证结合模型体现了中医证候因素已成为中医实验动物模型发展的新方向[5]和必然趋势[6]。湿热证型高脂血症在临床较常见[7-8]。研究表明[9-10]，湿热体质是动脉硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病的重要危险因素和发病基础，有关湿热型高脂血症的研究未见报道。本研究采用复合因素的造模方法，以湿热证的病因病机为依据，建立湿热型病证结合高脂血症大鼠模型，观察虎杖对此模型的作用，以期为降脂中药的药效及安全性评价和高脂血症的中医模型研究提供思路。

1 材料

1.1 动物健康清洁级SD大鼠，雄性，70只，5周龄，体质量(150±20) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：1140070014054。饲养环境：室温22～25 ℃，相对湿度60%～70%。

1.2 药物及试剂虎杖(郑州市中医院，批号：180303)；干姜(郑州市中医院，批号：20190401)；血脂康胶囊(北京北大维信生物科技有限公司，批号：20190517)；辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司，批号：T010966)。高脂饲料(83.3%基础饲料，1%胆固醇，0.5%胆酸钠，10%猪油，0.2%甲基硫氧嘧啶，5%蔗糖)(北京科澳协力饲料有限公司，批号：201809190)；白酒(红星二锅头，56度)。总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、白细胞介素-6(interleukin-6 IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA检测试剂盒(上海研盟生物科技有限公司，批号分别为：19021656、19012358、19023201、19011803、190243、190326)；三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding casstte transporter，ABCA1)、卵磷脂胆固醇乙酰转移酶(lecithin cholesterol acyltransferase，LCAT)、羊抗人载脂蛋白A1(goat anti-human apolipoprotein A-I polyclonal，ApoAI)试剂盒(武汉博士德生物工程公司，批号分别为：BA1541-2、BA3103-2、BM5624)。

1.3 仪器DHP-9012型电热恒温培养箱(武汉一恒苏净科学仪器有限公司)；TG-16m型高速冷冻离心机(Thermo公司)；RaytoRT-6100型酶标仪(美国雷杜公司)；Tianshi988型洗板机(北京拓普分析仪器有限公司)。

2 方法

2.1 药物制备将虎杖饮片浸泡30 min后，加10倍量水，煎煮40 min，滤取煎液；继续加8倍量水，煎煮30 min，合并两次水煎液，浓缩至每1 mL药液分别含原药材1.5 g、0.75 g，分别作为虎杖高剂量和低剂量组，4 ℃保存备用；干姜制备方法同虎杖，最后浓缩水煎液使每1 mL药液含原药材1.0 g，作为反证治疗组药液，4 ℃保存备用。

2.2 分组、造模及干预方法将SD大鼠以基础饲料适应性饲养5 d。除正常组外，其余组饲喂高脂饲料6周，观察其行为体征。6周后行眼眶静脉取血检测血脂指标，并称其体质量，选择与正常组(8只)对比血脂指标具有显著差异的大鼠共56只纳入实验[11]，其中不合格者6只。将挑选的大鼠随机分为模型对照组(高脂饮食+湿热环境组)、模型组(高脂饮食+湿热环境+白酒组)、虎杖(高、低剂量)(15、7.5 g·kg-1)组、反证治疗(干姜，10 g·kg-1)组、血脂康(0.3 g·kg-1)组、辛伐他汀(干姜，7.5 mg·kg-1)组，每组8只。从第7周，除正常组外，其余各组继续饲以高脂饲料，且每天置于人工气候箱内5 h(上午10～12时，下午14～17时)，气候箱温度设为 33 ℃，湿度为90 %，高脂饲料及人工气候箱均干预至第14周[12]。除正常组和模型对照组给予同等剂量生理盐水外，其余各组每天下午灌胃白酒 20 mL·kg-1。自第9周开始正常组、模型组和模型对照组给予等体积的生理盐水，其余各组给予相应的药物进行灌胃。

2.3 标本的采集于第14周实验结束，各组大鼠禁食12 h，称其体质量后水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，室温条件静置 30 min，4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清，-80 ℃保存。并摘取肝、肾、脾、肺、心脏器组织，称其质量。

2.4 观察指标

2.4.1 一般体征每天观察大鼠的活动状态、毛发颜色、进食饮水状况、大小便颜色质地等。

2.4.2 脏器指数大鼠的体质量及肝、肾、脾、肺、心的脏器指数。

脏器指数(%)=脏器质量/体质量×100%

2.4.3 血脂指标测定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。

2.4.4 血清生化指标测定血清中炎症因子(IL-6、TNF-α)及ABCA1、LCAT、ApoAI的水平。

3 结果

3.1 大鼠的一般情况在前6周高脂血症模型筛选过程中，正常组大鼠精神及活动状态良好，比较活跃，毛发顺滑有光泽、进食、二便无异常；其余组大鼠前期精神状态无异常，体型前两周与正常组相比无差异，最后两周明显肥胖，进食逐渐减少，精神状态尚可，活动减少，大便变软不成形，味臭。分组后在湿热环境(人工气候箱)下的各组大鼠普遍出现毛发发黄凌乱、大便溏泄、小便发黄、精神萎靡、活动减少；灌服白酒后出现大便溏泄加重，甚至出现肛周污秽；反证治疗组大便粘滞或干结。与模型组相比，虎杖组、血脂康组、辛伐他汀组大鼠精神状态均有所改善，活动增加。

3.2 对大鼠体质量、肝脏质量及脏器指数的影响与正常对照组相比，模型组和模型对照组体质量、肝质量和肝脏指数均显著增加(P<0.01)。与模型对照组相比，模型组肝质量及肝脏指数明显增加(P<0.05)；虎杖高、低剂量组体质量、肝质量及肝脏指数明显降低(P<0.05)。与模型组相比，虎杖高、低剂量组体质量、肝质量显著降低(P<0.01)，肝脏指数明显降低(P<0.05)，血脂康组、辛伐他汀组体质量、肝脏质量、肝脏指数明显降低(P<0.05)。虎杖高剂量组与血脂康组对体质量、肝质量及肝脏指数的降低作用相当，而虎杖低剂量组的作用优于前两者，辛伐他汀组优于虎杖低剂量组。见表1。

表1 对大鼠体质量、肝脏质量及脏器指数的影响

3.3 对大鼠肾、脾、肺、心脏器指数的影响经统计学分析，各组大鼠肾、脾、肺、心的脏器指数的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 对大鼠肾、脾、肺、心脏器指数的影响

3.4 对大鼠血脂指标的影响与正常对照组相比，模型对照组和模型组TC、TG、LDL-C水平均显著升高(P<0.01)，HDL-C水平显著降低(P<0.01)。与模型对照组相比，模型组TG、LDL-C水平均显著升高(P<0.01)。与模型对照组和模型组相比，虎杖高、低剂量组TC、TG、LDL-C水平均显著降低(P<0.01)，HDL-C水平无显著差异，但有升高的趋势(P>0.05)；血脂康组、辛伐他汀组TC、TG、LDL-C水平均显著降低(P<0.01)，HDL-C水平均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，反证治疗组TC水平升高(P<0.05)，LDL-C水平显著升高(P<0.01)。见表3。

表3 对大鼠血脂指标的影响

3.5 对大鼠血清炎性指标的影响与正常对照组相比，模型对照组和模型组IL-6、TNF-α水平均显著升高(P<0.01)。与模型对照组相比，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α水平均明显升高(P<0.05)；虎杖高、低剂量组和血脂康组、辛伐他汀组IL-6、TNF-α水平均显著降低(P<0.01)。与模型组相比，虎杖高、低剂量组和血脂康组、辛伐他汀组IL-6、TNF-α水平均显著降低(P<0.01)；反证治疗组血清IL-6、TNF-α 水平均无显著差异(P>0.05)。见表4。

表4 对大鼠血清炎性指标的影响

3.6 对大鼠血清ABCA1、LCAT、aPoA-I的影响与正常对照组相比，模型对照组和模型组血清ABCA1、LCAT、aPoA-I均显著降低(P<0.01)。与模型对照组相比，虎杖高、低剂量组和血脂康组血清ABCA1、LCAT均明显升高(P<0.05)，虎杖高剂量组血清aPoA-I有升高的趋势(P>0.05)，虎杖低剂量组和血脂康组血清aPoA-I明显升高(P<0.05)，辛伐他汀组ABCA1、LCAT、aPoA-I均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，虎杖高、低剂量组和血脂康组血清ABCA1、LCAT均明显升高(P<0.05)；虎杖低剂量组和血脂康组aPoA-I明显升高(P<0.05)；辛伐他汀组ABCA1、LCAT、aPoA-I显著升高(P<0.01)；反证治疗组血清 ABCA1、LCAT、aPoA-I均无显著差异(P>0.05)。见表5。

表5 对大鼠血清ABCA1/LCAT/aPoA-I的影响

4 讨论

《温热经纬·薛生白湿热病》：“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热”；《温热经纬·叶香岩外感温热》：“又有酒客，里湿素盛，外邪入里，与之相搏。在阳旺之躯，胃湿恒多；在阴盛之体，脾湿亦不少，然其化热则一”。这两段论述指出，湿热证“内湿”与“外湿”“相搏”合而为患，脾虚导致脾失健运(内湿)为本，外邪(外湿)入里为标。

现有单一高脂饲料喂养的造模方法[1，14-16]只体现了脾虚痰湿[17]的证候特征[11]，不能体现湿热的“证候”因素，违背了“有是证用是药”的思想，忽略了中医对疾病本质的认识——“证”的动态性和阶段性[6]。有关湿热证动物模型多见于温病湿热证的研究[18-24]，但其造模时间短，如湿热环境和灌服白酒多为5～10天[22，24]，其属于急性证候模型，且使用的致病微生物及细菌内毒从病因学的角度看多属于外感病因，从病因、病程[3]或者发病特征的角度这些方法与湿热型高脂血症不相符。

本研究结合“内湿”与“外湿”的致病因素及中医“肥甘饮食(或加酒)[18]”伤脾致虚的观点，加入白酒作为造模因素，使其自身的湿热的偏性作用于造模大鼠，使模型更加贴合湿热证的病机[18]和发病规律[19]。湿热证“外湿”的造模方法大多采用人工气候箱模拟湿热环境[25]，便于温湿度的控制。故本研究选择了“内湿(高脂饲料+白酒)+外湿(湿热环境)”的造模方法，将高脂血症疾病和湿热证的证候结合起来。针对湿热证缠绵的特征，本研究延长了造模时间，如湿热环境和灌服白酒的造模时间延长至8周，使之更贴合湿热证的发病特点。总之，本研究选择高脂血症疾病模型和湿热证的证候模型并改良之建立湿热型高脂血症病证结合模型。

本研究设置了辛伐他汀和血脂康两个阳性对照组，以进一步对比疗效和评价模型；设置了模型对照组(高脂饲料+人工湿热环境)，以考察白酒对模型的影响。本研究显示，与模型对照组相比，模型组TG、LDL-C水平均显著升高，模型组大鼠灌服白酒后出现大便溏泄加重，甚至有肛周污秽的湿热症状，说明白酒加重了湿热体征和血脂紊乱，但对血脂的其他指标没有明显影响。本研究参照他人的观点[6]，证明模型是否成功仅仅“以方测证”是不够的，还需要用非适应证的药物治疗无效才可以，为此设置了反证治疗组，以温热性质的干姜进行反证治疗。结果显示，反证治疗组给予干姜后大便出现黏滞或干结等不调的表现，且TC、LDL-C进一步升高，说明在模型组的基础上给予干姜会进一步加重脂质代谢紊乱及湿热体征，反证治疗组的加入在一定程度上佐证了模型的成功。通过对比模型对照组、模型组、反证治疗组的造模因素发现，其是一个湿热因素逐渐加重的过程，便于对比成模因素对湿热模型的影响。但由于造模因素的增加也会出现重复性差、操作难度大的问题，另外反证治疗组的作用也仅是对模型的佐证，而评价模型的成功是多角度的，这些问题均需进一步研究。

虎杖为清热利湿药，对湿热证有广泛的作用，结果表明造模后大鼠出现肥胖、进食减少、精神萎靡大便溏泄、甚至肛周污秽等典型的脾虚、湿热证的体征，说明“高脂饲料+白酒+人工湿热环境”可初步造成湿热证模型，且出现了血脂及肝质量、肝脏指数升高，说明湿热型高脂血症大鼠模型初步制备成功。虎杖高、低剂量组及血脂康组大鼠的精神状态及大便溏泄均有所改善；其中虎杖高、低剂量组小便发黄改善较明显；血脂方面，虎杖高、低剂量组对升高的TC、TG、LDL-C的升高均有显著的降低作用，其作用强度与血脂康相当，但弱于辛伐他汀，说明虎杖对湿热证高脂血症大鼠模型的体征和血脂紊乱均有改善。

炎性学说与血管内皮损伤学说均是冠状动脉粥样硬化性心脏病发病机制的重要的学说，炎性学说认为冠状动脉粥样硬化性心脏病是一种慢性炎症的过程，伴随着脂质沉积和血管内皮功能紊乱及损伤，经过一系列的趋化诱导[26]，单核细胞分化成巨噬细胞，从而释放一系列的炎症因子如IL-6、TNF-α等，引起血管壁的炎症反应。本研究显示，与模型对照组相比，模型组IL-6、TNF-α水平升高，炎症因子和炎症反应会增加脂质斑块的不稳定性和破裂的风险[27]，说明炎症反应随着湿热的加重而加重。虎杖高、低剂量及血脂康对IL-6、TNF-α有明显的降低作用，且低剂量组作用更好，与血脂康和辛伐他汀作用强度相当，说明虎杖对高脂血症模型的作用可能是通过抑制炎症因子的水平，从而提高了脂质斑块的稳定性，延缓动脉硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病的进展。

胆固醇的逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)[28]越来越受到重视，RCT是由HDL-C介导的将外周胆固醇转运至肝脏，并在肝脏内进行代谢的过程，从而降低了肝外组织血管壁的胆固醇水平，对延缓血管壁脂质沉积及动脉硬化有积极作用。RCT的主要途径为ABCA1/LCAT/aPoA-I通路[29]，其功能异常在动脉粥样硬化的发生发展中起着关键作用[30]。ABCA1、LCAT、ApoAI的低表达会阻碍游离胆固醇转化为失去极性的胆固醇酯，导致HDL-C介导的胆固醇转运效率低下，造成胆固醇在肝外的蓄积[12]。结果表明，虎杖高、低剂量及血脂康对造模引起的血清ABCA1、LCAT、ApoAI低表达有上调作用，且对ABCA1的作用与血脂康组相当，但弱于辛伐他汀组。这可能是其治疗湿热型高脂血症的作用机制之一。

对中药药性和功效的认知来源于疾病(证候)状态下机体对药物的反应[13]，故只有在疾病(证候)状态下的疗效或安全性评价才是准确的。本研究的高脂血症大鼠模型结合了高脂血症疾病模型和中医湿热证证候模型，体现了病证结合的思想，突出了方-证的适配性[32]，并观察了虎杖对此模型的作用，望能为湿热型高脂血症模型的研究和降脂中药的疗效与安全性评价做出一些有益的探索。