miR-181a 基因rs77418916 位点多态性与川崎病的关联性研究

姚美清，余 梦，吴吉平，黄利华，杨作成

（1.中南大学湘雅三医院儿科，长沙 410013；2. 中南大学湘雅三医院中心实验室，长沙 410013）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种急性、累及全身的系统性血管炎性疾病，主要影响5 岁以下儿童和婴幼儿，是儿童后天获得性心脏病的主要原因之一。至今川崎病的发病机制和病因尚不明了，认为川崎病可能是一种由不明原因感染引起的免疫系统高度活化，及细胞因子介导损伤性血管炎，使得心脏和冠状动脉受累，甚至可发展成为缺血性心脏病、心肌梗死［1］。遗传因素在川崎病的冠状动脉损伤（CAL）及遗传易感性中发挥一定的作用。miRNA 是一类保守的非编码小分子RNA，可在转录后水平调节多种蛋白质的表达。每个miRNA 可调控多种靶基因，在炎症、免疫和心血管疾病等方面发挥着重要作用。既往已经有关于miRNA基因多态性与川崎病的相关性进行了较多研究，如罗颉等［2］研究了mTOR 基因多态性与KD 的关联性，但未发现其rs6540964、rs75398396 位点多态性与KD 相关。Zha 等［3］发现，miR-146a 多态性与KD 并发CAL 相关，其rs2910164 位点G/C 的GG 基因型和rs57095329 A/G位点的A 等位基因可能是KD 并发CAL 的危险因素。报道显示，miR-181a 与自身免疫、炎症反应、心血管疾病的发生发展密切相关［4］，但有关miR-181a 基因多态性与川崎病的关联性尚未见报道。本研究通过病例对照的方法，探究miR-181a 基因rs77418916 位点多态性与KD 发病及其合并CAL 的关系。

1 资料与方法

1.1 对象 KD 组：随机选取2016 年～2019 年间在中南大学湘雅三医院治疗的100 例中国汉族KD 患儿，全部患儿均符合KD 的诊断标准［5］。所有患儿入院前均未使用丙种球蛋白（IVIG）和阿司匹林治疗。其中KD 合并CAL 的诊断指标为：＜3 岁患儿，冠脉内径≥2.5mm；＜5 岁患儿，冠脉内径≥3mm；≥5 岁者，冠脉内径≥4mm；存在某些节段冠脉内径为相邻段的1.5 倍以上；管壁不规则；冠状动脉内径/主动脉根部内径比值＞ 0.3［6］。本组资料中，川崎病合并冠状动脉损伤组（KDCAL）组25 例，其中男18 例，女7 例，平均年龄3.85±3岁；无冠状动脉损伤组（KD-NCAL）组75 例，其中男40例，女35 例，平均年龄4.19±1.92 岁。KD-CAL 组与KD-NCAL 组性别分布之间无统计学意义（P＞0.05）。

对照组：选择100 例在中南大学湘雅三医院做健康体检的中国汉族儿童，入选儿童既往无KD 病史，并排除风湿性疾病、心血管疾病、感染性疾病、肿瘤等。其中男性58 例，女性42 例，男女比例为1.38：1，年龄为1.68±2.05 岁。KD 组与对照组性别分布之间无统计学意义（P＞0.05）。

在征得患儿父母或监护人的同意后，用一次性采血管（含抗凝剂EDTA-K2）采取KD 组与对照组患儿2ml静脉血，血液标本用冷冻保存管装取，置于-80℃冰箱内贮存。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取 采用一次性采血管（含抗凝剂EDTA-K2）采取2 mL 静脉血，用Promega DNA 提取试剂盒，按说明书要求提取各组外周血DNA，用NanoDrop ND-2000C 分光光度计（Thermo，USA）进行纯度和浓度的测定，放入-80℃冰箱内贮存。

1.2.2 多态性检测 采用聚合酶链反应-直接测序法（PCR-SBT）技术检测miR-181a 基因多态性，通过GeneBank 检索到miR-181a 基因碱基序列，设计引物，上游引物为：5'-GTGGGTTGTTGAGAATTTAATGAG-3'，下游引物为：5'-CAGCGTTGAATGTTCCTTGG-3'，引物由铂尚生物技术（上海）有限公司合成。采用PCR 反应体系为25μL，包括制好的模板DNA 1μL，引物各1μL，2×Master Mix 10μL，去离子水加至25μL。PCR 扩增反应条件：在98℃下对样品进行3min 的预变性一次；随后加入Taq DNA 聚合酶进行如下的35 次循环：98℃（10s）→54℃（30s）→72℃（10s）；72℃终末延伸2min，4℃保存。

PCR 扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下照相观察结果并记录电泳图谱，初步判定扩展成功与否。PCR 扩增产物外送铂尚生物技术（上海）有限公司进行基因测序。测序结果用Chromas 软件分析。

1.3 统计学分析 数据分析采用SPSS 20.0 软件统计。计量资料采用平均数±标准差 表示，基因型和等位基因频率采用χ2检验，P＜0.05 表示结果具有统计学意义。使用Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验2 组基因型频率及等位基因频率是否符合遗传平衡。

2 结果

2.1 miR-181a 基因位点多态性检测 miR-181a 基因rs77418916 位点PCR 扩增片段大小为409 bp，使用1%琼脂糖凝胶电泳分离（图1）。将PCR 所得产物进行基因测序，显示rs77418916 位点存在AA、AT、TT 等3 种基因型（图2）。KD 组、健康对照组miR-181a 基因rs77418916 位点基因型频率分布差异无统计学意义（均P＞0.05），说明本研究的受试对象组间基因型频率符合遗传平衡定律，所选对象具有群体代表性。

图1 miR-181a基因rs77418916位点PCR扩增产物电泳图

图2 miR-181a基因rs77418916位点测序图 A：AA基因型；B：AT基因型；C：TT基因型

2.2 KD 患儿miR-181a 基因rs77418916 位点多态性的变化 在KD 组与健康对照组之间AA、AT、TT 基因型频率和 A、T 等位基因频率分布差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。miR-181a 基因rs77418916 位点多态性在KD-CAL 组与KD-NCAL 组间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 对照组与KD组miR-181a基因rs77418916位点多态性分布

3 讨论

川崎病的发病机制尚不清楚，有学者发现TNF-α、IL-1、IL-4 和IL-10 等炎性细胞因子在川崎病急性期升高，认为免疫系统的过度激活和细胞因子活化致血管炎与川崎病的发病相关［7］。相关研究显示，急性期KD 患儿的CD14+单核/巨噬细胞中NF-κB 活性明显增强［8］，NF-κB 在启动和调节炎症反应上游环节、诱导血管内皮细胞炎性因子产生及导致炎性损伤方面可能发挥重要作用［9］。

人类miR-181 家族包含4 个高度保守的的成员，它们分别是miR-181a、miR-181b、miR-181c 和miR-181d。其中miR-181a 基因定位于人1 号染色体，是一个多功能miRNA，针对不同的靶点在炎症反应、免疫分化、心血管中起重要作用，并可能通过相关通路参与影响川崎病的发生发展［10］。研究发现，miR-181a 能够调节TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6 和IL-8 的表达，进而调节炎症反应［11］。Xie 等［12］发现，在炎症刺激状态下miR-181a 在巨噬细胞和单核细胞中表达下调，IL-1α表达上调，同时证实了miR-181a 的靶基因是IL-1α，miR-181a 的过表达显着降低了炎性细胞因子（如IL-1β，IL-6 和TNF-α）的产生，同时miR-181a 可通过靶向TLR4 表达来抑制NF-κB 活化和活性氧（ROS）的积累，证实了miR-181a 的抗炎作用［11］。

KD 可导致冠状动脉损伤，甚至心肌梗死，已成为儿童获得性心脏病的常见原因。研究发现miR-181a的过表达减少了氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）介导的CD83 和CD40 的增加，减少IL-6 和TNF-α的分泌，并增加IL-10 的表达。这些作用由靶向c-Fos 的3'-UTR的miR-181a 介导，miR-181a 以负反馈的方式抑制了ox-LDL 诱导的炎症［13］。Du 等［14］发现miR-181a 可通过靶向人类巨噬细胞中的TLR4 抑制ox-LDL 诱导的血管炎症。Habib 等［15］发现TLR4 依赖的巨噬细胞信号传导与冠状动脉疾病有关。由于miR-181a 基因位点的多态性可影响相关基因的表达，导致其信号通路的异常活化，进而引起机体免疫反应的过度激活，从而引起急性全身性血管炎。本研究显示，miR-181a 基因rs77418916 位点在KD 组与健康对照组之间AA、AT、TT 基因型频率和 A、T 等位基因频率分布差异无统计学意义，说明miR-181a 基因rs77418916 位点的多态性与KD 易感性及CAL 存在关联的可能性小。可能为本研究中样本量偏小，或因不同地区及民族的遗传差异所致，亦或KD 的发病并非通过该位点多态性产生影响等，有待进一步研究。