电针“百会”“腰奇”对癫痫模型大鼠行为学及肠道菌群的影响

文立杨，程为平，程光宇，张奇，王轩

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

作为临床上常见的慢性中枢神经系统疾病之一，癫痫主要因脑神经元异常放电引起。流行病学资料显示[1],我国癫痫患者约900万人，每年新增70多万例,50%以上患者有认知功能障碍,严重危害生命健康。研究表明[2]，针灸有通过调节肠道菌群平衡达到治疗相关病症的作用。电针(electroacupuncture，EA)是针刺得气后针柄联接电针治疗仪，给予微量生物电流波，使针感持续的方法。本研究通过观察电针“百会”“腰奇”对PTZ致痫大鼠行为学及肠道菌群丰度的变化,基于肠道菌群探讨电针的抗痫作用机制。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

24只SPF级雌性SD大鼠，8周龄，体质量200～250 g,黑龙江中医药大学动物实验中心提供，许可证号: SYXK(黑)2019-004。实验室湿度控制在45%～60%, 温度控制在17～24 ℃。在适应性喂养1周后, 将大鼠编号、称重, 用计算机生成的随机数字表选取其中8只作为空白组(N组),余16只在戊四氮点燃模型成功后平均分为模型组(M组)和电针组(E组)。

1.2 实验试剂与仪器

戊巴比妥钠(Pentetrazol-PTZ,美国Sigma公司,货号:Sigma-p6500-25G)配制成戊四氮溶液(PTZ溶液,浓度:2 mg/mL);10%水合氯醛溶液(天津市大茂化学试剂厂);SDZ-Ⅱ电针治疗仪(苏州医疗用品有限公司);0.18 mm×13 mm华佗牌毫针;-80 ℃立式超低温冰箱(DW-86L8281型,Haier公司);Hiseq测序仪(Illumina公司)。

1.3 造模方法

每天选取固定时间(8:00—10:00 AM),除空白组大鼠外,剩余16只大鼠腹腔注射PTZ(35 mg/kg),空白组给予腹腔注射等剂量的0.9% NaCl注射液,观察大鼠的行为学变化并记录Ravine分级[3]。0级:大鼠正常无抽搐发作；Ⅰ级:大鼠仅面部抽动;Ⅱ级:大鼠出现湿狗样点头抖动;Ⅲ级:单侧前肢阵挛性发作;Ⅳ级:大鼠前肢阵挛抬起伴站立;Ⅴ级:大鼠全面发作伴站立及跌倒。模型制备周期为28 d,至少连续3次不低于Ⅵ级的发作即认为造模成功。在造模过程中,若大鼠持续Ⅴ级发作超过5 min不能停止，应当立即给予腹腔注射10%的水合氯醛(5 mg/kg)干预,防止死亡。

1.4 干预方法

造模成功后,每组予以相应的干预治疗。其中,空白组和模型组大鼠除每天固定时间(08:00—11:00 AM)用保定器固定10 min外,不给予其他干预。电针组大鼠于每天相同时间保定器固定,针刺“百会”“腰奇”,取穴参照《实验针灸学》[4],其中“百会”向后平刺2 mm;“腰奇”向前平刺1.3 mm;针刺完毕将电针治疗仪的正极连接在百会穴针柄上,负极连接在腰奇穴针柄上,给予频率100 Hz的连续波,根据大鼠耐受程度选择电针治疗仪的强度,每天治疗10 min,连续治疗14 d。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠一般情况

观察大鼠的一般状态, 如精神状况、反应速度、体质量、进食、毛发等。

1.5.2 全面强直阵挛发作(GTCS)和极小阵挛发作(MCS)潜伏期

连续治疗14 d, 根据Racine分级,观察各组大鼠GTCS潜伏期和MCS潜伏期。

1.5.3 Morris水迷宫实验

各组大鼠第14天的治疗结束后，分别进行Morris水迷宫实验，以评估各组大鼠的空间学习记忆能力情况。水迷宫实验由定位航行和空间探索两个实验构成，共进行6 d。首先进行定位航行实验，共5 d,每天上午2次,下午2次,每次实验开始从Ⅰ～Ⅳ任意象限的固定位置将大鼠面向水池壁放入池中,记录最后一天大鼠的逃避潜伏期，即从大鼠进入水中开始直到其找到水中平台并爬上平台的时间。空间探索实验在第6日进行，将水迷宫中的平台撤除，使每组大鼠从同一象限的同一位点进入水中，记录SD大鼠在120 s内为搜索平台而穿越原平台所在象限的次数。

1.5.4 肠道菌检测

利用16srDNA测序技术检测肠道菌群。14 d的治疗结束后，对各组大鼠粪便进行搜集,具体方法：将经过紫外线杀菌的清洁用纸置于鼠盒内,每只大鼠在鼠盒中自然排便后,收集3～4粒无污染的粪便放置于EP管中,快速放入液氮中速冻以防止降解,放入-80 ℃冰箱待用。测序具体流程如下,①DNA的提取:使用PowerSoilR DNA分离试剂盒，从粪便样本中提取DNA;②PCR的扩增:用灭菌水将提取的粪便样品的DNA稀释至1 ng/μL,稀释所得DNA为模版,靶标为粪便中的细菌16srRNA，其中的v3-v4高可变区序列,扩增后得PCR产物;③测序：PCR产物经电泳检测浓度、纯度后经纯化,最后使用试剂盒对PCR产物Qubit定量,基因组测序由Ⅰ llumina Hiseq测序平台完成;④数据处理：设置序列的相似性阈值为97%进行OTU聚类,其中OTU是根据相似性进行分组的操作分类单元，使用Userach对嵌合体序列进行鉴定并移除。因每个OTU均有1个有代表性的序列，故可利用Silva Classifer分类数据库对每个代表性序列进行对应的物种注释。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠一般情况

空白组(N组)大鼠精神状况良好,反应灵敏、毛发泛有光泽，食量正常。与空白组比较，模型组(M组)大鼠表现为反应迟缓、毛发暗黄、摄食减少、体质量增长缓慢,易受激惹。电针组(E组)大鼠整体状态改善,与模型组相比,反应渐灵活,毛发润泽,食量渐增,大发作次数减少,持续时间明显缩短。

2.2 GTCS和MCS潜伏期

E组GTCS潜伏期明显较M组延长(P<0.05)；N组大鼠未见癫痫发作。与M组相比,E组MCS潜伏期明显延长(P<0.05)。N组大鼠未见痫性发作。详见表1。

表1 各组大鼠GTCS和MCS潜伏期比较

2.3 Morris水迷宫实验

与N组相比,M组大鼠的逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数明显减少，有统计学意义(P<0.05)；与M组比较,E组逃避潜伏期及穿越平台次数有统计学意义(P<0.05),逃避潜伏期较M组明显变短,穿越平台次数较M组增多。详见表2。

表2 各组大鼠Morris水迷宫实验潜伏期和穿越平台次数比较

2.4 Alpha多样性分析

16srDNA测序中3组大鼠的粪便样本，经质控后每个样本获得50 818条有效序列，长度平均417～429。观察初步随机抽样构建的稀释曲线 (见图1和图2)可发现，曲线随着测序数据量增加而趋于平缓，即每个样本的物种数量(Sobs)不会随之继续增加，说明目前的测序深度基本能覆盖大鼠粪便样品中的微生物种类，本研究所有样本序列充分。

图1 M组和N组Alpha多样性指数稀释曲线图

图2 E组和M组Alpha多样性指数稀释曲线图

2.5 Beta多样性分析

N与M组大鼠肠道菌群PCoA得分图(见图3)显示,样本组成差异的PC1贡献度为24.35%，PC2为20.40%。两组数据无论是密度还是空间距离均不相同，说明两组样本完全分开，结合Adonis非参数分析，得到P=0.006<0.05，R2=0.146，差异有统计学意义。E组与M组大鼠肠道菌群PCoA得分图(见图4)显示,样本组成差异的PC1贡献度为25.42%，PC2为15.78%。同时结合Adonis分析得到P=0.002<0.05，R2=0.164，差异有统计学意义。可见M组较N组大鼠的肠道菌群结构发生了改变，而电针可促进恢复肠道菌群组成结构。

图3 M组和N组大鼠肠道菌群PCoA平面图

图4 E组和M组大鼠肠道菌群PCoA平面图

2.6 组间差异分析

通过LEfSe分析各丰度间差异的影响，找到显著差异影响的菌群。LEfSe进化树图中的每个圆圈代表该水平的一个分类，圆圈大小与丰度呈正比，从内到外分别代表门至种的分级；不同颜色代表不同组别，相同颜色的节点表示在组中显著富集，并对组间差异有显著影响的菌群;若在两组中均无显著差异的微生物类群则用黄色节点表示。结果,在电针组中丰度显著下调的菌群有5个为普雷沃氏菌科、普雷沃氏菌属-9、拟杆菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目，而普雷沃氏菌_NK3B31在模型组内显著下降，以聚类树体现结果，见图5和图6。

图5 M组LEfSe多级物种层级树图

图6 E组和N组LEfSe多级物种层级树图

2.7 门水平下的菌群差异

通过对各组大鼠门水平分类下不同菌群的丰度进行比较发现,与N组相比,M组大鼠疣微菌门丰度升高、螺旋体门丰度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；门水平分类下E组与M组相比，疣微菌门和拟杆菌门丰度明显降低(P<0.05)。详见表3、图7和图8。

表3 各组大鼠门水平下不同菌群的丰度比较

图7 E组和N两组门水平菌落bar图

3 讨论

癫痫是一种反复发作的慢性脑病，可对中枢神经系统产生不可逆的损害，无论对患者的认知功能还是对其家庭的生活质量都有极大影响[5]。本实验采用戊四氮点燃大鼠模型，可以较好的模拟癫痫发作易反复的特点[6]。应用水迷宫实验因其可较好的观察大鼠行为学变化，并反映其认知功能。干预方法选用电针，因在癫痫治疗方面，针灸疗效显著、安全性高、价格低廉，电针在针灸的基础上给予电流刺激，可使针感持续[7]。针灸治疗癫痫历史悠久，早在《黄帝内经》就有关于针灸治疗癫痫的记载。实验中针刺“百会”“腰奇”因癫痫病位在脑，而督脉上行入络脑，故治痫首选督脉。百会穴位于头顶，有沟通阴阳脉络、清利头目、醒脑开窍的作用，百会穴的使用体现了腧穴的近治作用；腰奇穴位于腰骶, 为经外奇穴, 有振奋阳气、疏调督脉的作用,为治疗癫痫的要穴。两穴上下沟通，共奏补脑益髓、抵御外邪、定痫开窍的作用。现代研究表明[8]，百会与腰奇配伍，可有效延长大鼠的惊厥潜伏期、同时增加海马中NO的含量、增强NOS及SOD的活性。柳成刚等[9]研究发现,针刺百会与腰奇可降低PTZ致痫大鼠血清IL-1β表达、升高IL-6的表达,减轻海马神经元的损伤程度。前期实验发现[10]，电针“百会”“腰奇”能有效降低PTZ癫痫大鼠脑电的振幅，升高Beta、Gamma的主频率,延长癫痫发作潜伏期。此外，有研究表明[11]，针刺可通过调节肠道菌群结构及脑肠肽含量在疾病的预防及恢复中起关键作用。本研究通过PTZ诱导建立慢性癫痫模型，以电针为干预手段，选“百会”“腰奇”常用抗痫穴，分析电针对癫痫模型大鼠的行为学及肠道菌群的影响，并基于肠道菌群的角度探讨电针的抗痫机制。

研究显示[12]，癫痫的发生与肠道菌群关系密切。肠道菌群可以通过免疫途径参与癫痫的发生，这可能与肠道微生物产生的色氨酸代谢物影响转化生长因子 α(transforming growth factor-α,TGFα)和血管内皮生长因子-β(vascular endothelial growth factor -β,VEGF-β)的产生，从而影响中枢神经系统调节炎症有关[13]。此外，肠道菌群还可以通过影响神经递质的合成及代谢参与癫痫发病，研究表明[14]肠道微生物结构因生酮饮食干预而发生改变，提高海马GABA/glu比值，预防癫痫发作。肠道中菌群可分为肠道中大量存在，和消化功能相关的优势菌群，与数量少和消化功能不密切的劣势菌群。 另有研究发现[15]，大鼠肠道中的优势门菌群为厚壁菌门、拟杆菌门，其中，拟杆菌门是肠道中一种常在菌群，厚壁菌门多为革兰阳性菌，是细菌的高级分类单元，其细胞壁厚度约10～50 nm，有细胞壁结构。作为肠道的优势菌种，两者可通过维持肠道菌群的平衡和稳定，使肠道黏膜屏障的结构和功能完整[16]。有研究表明[17],消化性溃疡患者，肠道菌群存在优势菌群比例失调的情况，与变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门等菌门相关。 Kelly等[18]也发现肠道菌群多样性越高，菌群的分布越均匀，机体免疫功能水平越稳定，其机制可能与肥大细胞的功能相关。

针灸对肠道菌群有调节作用[19],本次实验发现，各组大鼠的粪便样本中门水平菌群情况基本一致，优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门，这与前人的研究[15]结果一致。模型组大鼠和空白组相比,厚壁菌门为升高趋势,拟杆菌门为降低趋势，未出现优劣势菌群倒置，但在门分类下模型组大鼠的肠道总微生物群落减少。可见在癫痫发作时，虽然降低了优势菌群比例但优势菌群不变，这与优势菌门能对抗癫痫发作时的应激反应相关，拟杆菌门出现降低趋势因其较厚壁菌门更容易受到癫痫的干扰。上述变化与模型组行为学结果一致，在Morris水迷宫实验中发现，模型组表现出逃避潜伏期较空白组长，且穿越平台的次数减少，说明戊四氮造模后大鼠的认知功能发生障碍，以记忆及空间学习能力下降为主。结合β多样性 PCoA 分析，相互聚集的样本其群落组成和结构相似度高，可视化后距离也接近，与空白组相比模型组有样本出现了离群，说明与正常状态相比癫痫时，群落的结构改变，体现了拟杆菌门的降低趋势。与模型组相比，电针组大鼠数的逃避潜伏期缩短、平台穿越次数增多，提示电针能改善癫痫大鼠的认知功能，保护神经元，与以往研究[8-9]结果相一致。电针干预后大鼠的厚壁菌门趋势升高、拟杆菌门为降低趋势，虽然两者均为未达到正常组比例，但仍为优势菌群。结合β多样性 PCoA 分析，与模型组对比，电针组样本群落聚集在NMDS1负向且具有明显的差异性，两组间差异离散趋势明显，说明电针干预可以在一定程度上改善肠道菌群失衡，促进癫痫后的修复。

综上所述，本实验通过观察大鼠行为学改变、肠道菌群结构丰度的变化，表明电针“百会”“腰奇”对癫痫模型大鼠有较好的抗痫效果，其机制可能与肠道菌群结构得到调节和恢复有关。