siRNA-YAP1对TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞上皮-间质转化的抑制作用

郑柳 胡超 杨彬彬 杨兴刚 丁芝祥

桂林医学院附属医院眼科 541001 胡超现在芜湖市眼科医院 241000

后发性白内障即晶状体后囊膜混浊(posterior capsule opacification，PCO)，是白内障术后的主要并发症之一。白内障术后残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)发生增生、迁移、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及细胞外基质的合成等一系列病理变化，引起正常光滑的后囊膜皱缩形成PCO，导致视力下降[1]。EMT是上皮样细胞向肌成纤维细胞转变的异常分化过程，是PCO发生的关键[2]。转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)是诱发纤维化形成的生长因子。TGF-β2通过激活经典Smad信号传导通路、PI3K/Akt通路和其他通路调节LECs的移行、增生和EMT过程，影响PCO的发生[3-5]，10 ng/ml TGF-β2诱导HLEB-3细胞发生EMT是研究PCO的适当模型[1,6-7]。Hippo信号通路在机体发育和疾病中发挥重要作用，参与胚胎眼形成的多个阶段，其调节紊乱可能导致病理组织过度生长和肿瘤的进展[8-9]。Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)是一种转录共激活因子，通过激活靶转录因子(如TEAD家族)，促进细胞增生，抑制细胞凋亡，诱导基因表达、致癌转化和EMT，从而在调控器官大小和组织稳态中发挥重要作用[10]。通过条件性敲除发育小鼠YAP基因的研究证明，Hippo/YAP信号通路参与维持LECs和晶状体纤维的形态[11]。目前RNA干扰技术在PCO防治中已被广泛应用[12]，采取YAP基因沉默的方法是否可以阻断人LECs的EMT过程尚未完全阐明。本研究探讨小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)-YAP1对TGF-β2诱导人LECs EMT的抑制作用，为PCO的预防提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞来源 永生化人LECs(HLEB-3细胞)购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2主要试剂及仪器 南美胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Gemini公司)；DMEM低糖细胞培养液、质量分数0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)；青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)；TGF-β2(美国Prospec公司)；siRNA(上海吉玛公司)；Trizol试剂、lipofectamine 3000(美国Invitrogen公司)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；实时荧光定量PCR试剂盒(Power SYBR Green I Master Mix)(美国ABI公司)；引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)；兔抗人E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体(AB40772)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)抗体(AB92547)、兔抗人YAP1抗体(AB205270)(美国Abcam公司)；FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)、小鼠抗人β-actin抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记山羊抗兔IgG(H+L)、HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中山金桥生物技术有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。PVDF膜(美国Millipore公司)；PCR仪(美国Life公司)；ABI 7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；电泳仪、酶标仪(美国Bio-Rad公司)；倒置荧光显微镜(美国AMG公司)；荧光显微镜(德国Carl Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1HLEB-3细胞培养 将细胞复苏后培养在含体积分数15% FBS和质量分数1%青链霉素混合液的opti-DMEM低糖培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞达到约80%融合时弃培养液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，加入质量分数0.25%胰蛋白酶消化约2 min，光学显微镜下观察。待细胞变圆、漂浮后，立即加入完全培养基终止消化，均匀吹打细胞，使细胞全部单个脱落。将细胞悬液转移至15 ml离心管中，离心半径15 cm，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，向离心管中加入完全培养液4 ml，吹打、重悬细胞，进行1∶ 3传代培养，用于后续实验。

1.2.2TGF-β2诱导HLEB-3细胞EMT模型的建立 将培养的细胞分为正常对照组和TGF-β2诱导组，正常对照组细胞采用无血清opti-DMEM低糖培养基进行培养，TGF-β2诱导组细胞在含终质量浓度为10 ng/ml TGF-β2的opti-DMEM低糖培养基中培养24 h，倒置显微镜下观察各组细胞的形态变化，建立TGF-β2诱导HLEB-3细胞EMT模型。采用Western blot法检测各组细胞中EMT相关标志物蛋白E-cadherin和Vimentin的表达变化；分别采用Western blot法、细胞免疫荧光法以及实时荧光定量PCR法检测各组细胞中YAP1蛋白及其mRNA表达。

1.2.3细胞转染及转染后TGF-β2诱导 将HLEB-3细胞分为正常对照组、阴性对照组、siRNA1-YAP1组、siRNA2-YAP1组和siRNA3-YAP1组，转染前24 h将培养的细胞接种于6孔板并用完全培养基进行培养，细胞密度约为1×105个/孔，待细胞融合至约80%，参照lipofectamine 3000说明书分别在培养基中加入Opti-DMEM培养基、siRNA空质粒、siRNA1-YAP1、siRNA2-YAP1和siRNA3-YAP1进行转染。siRNA1-YAP1序列：正向引物为5’-GACGACCAAUAGCUCAG AUTT-3’，反向引物为5’-AUCUGAGCUAUUGGUCG UCTT-3’；siRNA2-YAP1序列：正向引物为5’-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3’，反向引物为5’-UUUGGUUGAUAGUAUCACCTT-3’；siRNA3-YAP1序列：正向引物为5’-CUGCCACCAAGCUAGAUAATT-3’，反向引物为5’-UUAUCUAGCUUGGUGGCAGTT-3’；siRNA-阴性转染组(negative control，NC)序列：正向引物为5’-GCGACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3’，反向引物为5’-AUCUUAGGCAGAUCGUCGCdTdT-3’。转染后6 h，倒置荧光显微镜下观察转染效率。绿色荧光代表羧基荧光素(carboxyfluorescein，FAM)荧光标记的siRNA，细胞显示荧光代表转染成功。转染成功后，用含终质量浓度为10 ng/ml TGF-β2的DMEM继续培养48 h。采用Western blot法检测HLEB-3细胞中YAP1蛋白的表达水平，以检测转染效果。选取转染效果最佳的siRNA-YAP1进行后续实验。

将培养的HLEB-3细胞分为siRNA空载体组、siRNA-YAP1转染组、siRNA空载体+TGF-β2组和siRNA-YAP1+TGF-β2组。采用实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光染色和Western blot法检测各组细胞中YAP1 mRNA及其蛋白的相对表达量，以检测转染效果，并采用Western blot法检测各组细胞中EMT相关标志物蛋白E-cadherin和Vimentin的表达变化。

1.2.4实时荧光定量PCR法测定HLEB-3细胞中YAP1 mRNA表达 采用Trizol RNA提取试剂盒从细胞中提取总RNA，用Fast Quant RT试剂盒将总RNA 1 μg逆转录成第一链cDNA。按照SYBR Green I Master试剂盒配置荧光反应体系，加入八联管中进行反应，以β-actin作为内参。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃反应60 s，共40个循环。YAP1序列：正向引物为5’-CCTGCGTAGCCAGTTACCAACAC-3’，反向引物为5’-GCTGCTCATGCTTAGTCCACTGTC-3’；β-actin序列：正向引物为5’-CCTGGCACCCAG CACAAT-3’；反向引物为5’-GGGCCGGACTCGTCA TAC-3’。采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。实验独立重复3次。

1.2.5Western blot法检测HLEB-3细胞内E-cadherin、Vimentin和YAP1蛋白表达 采用适量RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂(体积比为100∶ 1)混合液于冰上充分裂解细胞30 min。离心半径10 cm，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，BCA法测定蛋白质量浓度，加入1/3体积4倍蛋白上样缓冲液，煮沸10 min,蛋白变性后分装于EP管中，置于-80 ℃冰箱内保存。将等量的蛋白样品用质量分数10% SDS-PAGE分离，然后转膜至PVDF膜上。用质量分数5%脱脂奶粉在TBST中封闭膜，滴加相应一抗(均1∶ 1 000)，4 ℃过夜，次日取出条带，用TBST冲洗后，用相应二抗(均1∶ 1 000)孵育膜，凝胶成像系统照相。以β-actin为内参。采用Image J软件测定蛋白条带灰度值，各蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/β-actin灰度值。实验独立重复3次。

1.2.6免疫荧光染色法检测HLEB-3细胞内YAP1蛋白表达 将培养的细胞接种于放有盖玻片的24孔板上并用完全培养基继续培养，用预冷的质量分数4%多聚甲醛固定各组处理细胞10 min。PBS洗3次，用体积分数0.5% TritonX-100处理20 min；质量分数4%的牛血清白蛋白在室温下封闭30 min，弃封闭液，加入YAP1抗体(1∶ 200)稀释液，4 ℃孵育过夜，与FITC标记山羊抗兔(1∶ 800)室温下孵育1 h。用含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)的封闭液封片，荧光显微镜下观察各组细胞中YAP1蛋白荧光状态。蓝色荧光显示DAPI核染，绿色荧光标记YAP1蛋白。实验独立重复3次。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 23.0统计学软件进行统计分析。计量指标的数据资料经Shapiro-Wilk检验证实符合正态分布，以mean±SD表示，组间均数经Levene检验证实方差齐。TGF-β2诱导实验各指标评估采用均衡分组单因素干预两水平研究设计，TGF-β2诱导组与正常对照组间各检测指标的差异比较采用独立样本t检验。细胞转染实验各指标评估采用均衡分组单因素干预多水平研究设计，组间各检测指标总体差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β2诱导后HLEB-3细胞形态变化及细胞中EMT相关标志物表达变化

正常对照组培养的HLEB-3细胞呈多边形，TGF-β2诱导组细胞由多边形变成长纺锤形(图1)。Western blot法检测结果显示，TGF-β2诱导组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量为0.830±0.104，低于正常对照组的1.180±0.118，差异有统计学意义(t=3.857，P=0.018)；TGF-β2诱导组细胞中Vimentin蛋白相对表达量为1.240±0.110，高于正常对照组的0.797±0.110，差异有统计学意义(t=-4.933，P=0.008)(图2)。

图1 光学显微镜下观察2个组HLEB-3细胞培养后24 h形态变化(×100，标尺=100 μm) A：正常对照组细胞呈多边形 B：TGF-β2诱导组细胞呈长纺锤形 图2 2个组细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表达比较 A：2个组细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表达电泳图 B：2个组细胞中E-cadherin相对表达量比较 C:2个组细胞中Vimentin相对表达量比较 与正常对照组比较，aP<0.05(独立样本t检验，n=3) TGF：转化生长因子；Vimentin：波形蛋白；E-cadherin：E-钙黏蛋白；β-actin:β-肌动蛋白Figure 1 Morphology of HLEB-3 cells cultured for 24 hours in the two groups under light microscope (×100,bar=100 μm) A:The cells in the normal control group were polygonal B:The cells in the TGF-β2 induced group were spindle-shaped Figure 2 Comparison of E-cadherin and Vimentin protein expression between the two groups A:E-cadherin and Vimentin protein expression electrophoretogram of the two groups B:Comparison of the relative expression of E-cadherin between the two groups C:Comparison of the relative expression of Vimention between the two groups Compared with the normal control group,aP<0.05(Independent-samples t test,n=3) TGF:transforming growth factor

2.2 TGF-β2诱导后HLEB-3细胞中YAP1表达变化

与正常对照组比较，TGF-β2诱导组细胞中YAP1蛋白荧光明显增强，YAP1蛋白电泳表达条带增强。TGF-β2诱导组细胞中YAP1 mRNA和蛋白的相对表达量分别为2.200±0.193和1.203±0.121，显著高于正常对照组的1.136±0.123和0.967±0.025，差异均有统计学意义(t=-9.288，P<0.01；t=-3.329，P=0.029)(图3)。

2.3 不同转染组HLEB-3细胞中转染效率和YAP1蛋白表达

倒置荧光显微镜下观察可见,FAM标记的阴性对照组转染效率均达80%以上，可以进行后续实验。正常对照组、阴性对照组、siRNA1-YAP1组、siRNA2-YAP1组和siRNA3-YAP1组细胞中YAP1蛋白相对表达量分别为1.317±0.225、1.182±0.132、0.264±0.079、0.163±0.067和0.188±0.091，总体比较差异有统计学意义(F=40.308，P<0.01)；与正常对照组、阴性对照组比较，siRNA1-YAP1组、siRNA2-YAP1组和siRNA3-YAP1组细胞中YAP1相对表达量均明显下降，差异均有统计学意义(均P<0.01)(图4)。siRNA1-YAP1、siRNA2-YAP1和siRNA3-YAP1均能有效抑制YAP1表达，siRNA2-YAP1组YAP1蛋白相对表达量最少，选取siRNA2-YAP1进行后续实验。

2.4 不同转染组TGF-β2诱导后HLEB-3细胞中YAP1蛋白及其mRNA相对表达量比较

与siRNA空载体组比较，siRNA-YAP1转染组细胞中YAP1荧光强度明显减弱，siRNA空载体+TGF-β2组中YAP1荧光明显增强；与siRNA空载体+TGF-β2组相比，siRNA-YAP1+TGF-β2组细胞中YAP1荧光明显减弱。siRNA空载体组、siRNA-YAP1转染组、siRNA空载体+TGF-β2组和siRNA-YAP1+TGF-β2组YAP1蛋白相对表达量分别为1.327±0.021、0.303±0.057、1.453±0.021和0.320±0.104，YAP1 mRNA相对表达量分别为1.156±0.175、0.576±0.108、2.048±0.329和0.572±0.022，总体比较差异均有统计学意义(F=340.851，P<0.01；F=51.432，P<0.01)，其中siRNA-YAP1转染组YAP1蛋白及其mRNA相对表达量明显低于siRNA空载体组，差异均有统计学意义(均P<0.01)，siRNA-YAP1+TGF-β2组细胞中YAP1蛋白及其mRNA相对表达量明显低于siRNA+TGF-β2组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；siRNA空载体+TGF-β2组细胞中YAP1蛋白及其mRNA相对表达量明显高于siRNA空载体组，差异均有统计意义(均P<0.05)(图5)。

图3 2个组培养后24 h HLEB-3细胞中YAP1蛋白表达比较 A：细胞免疫荧光染色可见正常对照组中YAP1蛋白少量表达，呈绿色荧光(FITC)，DAPI核染呈蓝色荧光(×200，标尺=50 μm) B：细胞免疫荧光染色可见TGF-β2诱导组YAP1蛋白表达明显增多，荧光明显增强(×200,标尺=50 μm) C：2个组细胞中YAP1 mRNA相对表达量比较 与正常对照组比较，aP<0.05(独立样本t检验，n=3) D：2个组细胞中YAP1蛋白表达电泳图 E：2个组细胞中YAP1蛋白相对表达量比较 与正常对照组比较，aP<0.05(独立样本t检验，n=3) YAP：Yes相关蛋白；TGF：转化生长因子；β-actin:β-肌动蛋白 图4 不同转染组HLEB-3细胞中转染效率和YAP1蛋白表达比较 A：倒置荧光显微镜下观察可见阴性对照组细胞形态正常(标尺=20 μm) B：倒置荧光显微镜下观察可见阴性对照组80%细胞具有绿色荧光(标尺=20 μm) 绿色荧光代表FAM荧光标记的siRNA，细胞显示荧光代表转染成功 C：不同转染组HLEB-3细胞中YAP1蛋白表达电泳图 D：不同转染组HLEB-3细胞中YAP1蛋白相对表达量比较 与正常对照组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05(单因素方差分析，LSD-t检验，n=3) 1：正常对照组；2：阴性对照组；3：siRNA1-YAP1组；4：siRNA2-YAP1组；5：siRNA3-YAP1组 YAP：Yes相关蛋白；β-actin:β-肌动蛋白Figure 3 Comparison of YAP1 protein expression in HLEB-3 cells cultured for 24 hours between the two groups A:In the control group,the immunofluorescence staining showed a small amount of YAP1 protein (green fluorescence，FITC),and DAPI staining showed nucleus (blue fluorescence) (×200,bar=50 μm) B:In the TGF-β2 induced group,the immunofluorescence staining presented enhanced fluorescence,suggesting that the expression of YAP1 proteins was increased significantly ( ×200,bar=50 μm) C:Comparison of YAP1 mRNA relative expression between the two groups Compared with the normal control group,aP<0.05 (Independent-samples t test,n=3) D:YAP1 protein expression electrophoregram of the two groups E:Comparison of YAP1 protein expression between the two groups Compared with the normal control group,aP<0.05 (Independent-samples t test,n=3) YAP:Yes-associated protein;TGF:transforming growth factor Figure 4 Comparison of transfection efficiency and YAP1 protein expression in HLEB-3 cells among various groups A:Normal cell morphology in the negative control group was observed under an inverted fluorescence microscope (bar=20 μm) B:The 80% of cells in the negative control group showed green fluorescence under the inverted fluorescence microscope (bar=20 μm).Green fluorescence represented FAM fluorescently labeled siRNA,and cells showing fluorescence indicated successful transfection C:YAP1 protein expression electrophoretogram of HLEB-3 cells among various groups D:Relative expression of YAP1 proteins in HLEB-3 cells among various groups Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the negative control group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1:normal control group;2:negative control group;3:siRNA1-YAP1 group;4:siRNA2-YAP1 group;5:siRNA3-YAP1 group YAP:Yes-associated protein

2.5 不同转染组TGF-β2诱导后HLEB-3细胞中EMT指标蛋白表达比较

各转染组E-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义(F=20.225，P<0.01；F=52.541，P<0.01)，其中与siRNA空载体组相比，siRNA-YAP1转染组细胞中的E-cadherin蛋白荧光增强，相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)，2个组Vimentin蛋白荧光未见明显差异，相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；与siRNA空载体组相比，siRNA空载体+TGF-β2组细胞中的E-cadherin蛋白荧光减弱，相对表达量明显降低，Vimentin蛋白荧光增强，相对表达量升高，差异均有统计学意义(均P<0.01)；与siRNA-YAP1转染组相比，siRNA-YAP1+TGF-β2组中E-cadherin蛋白荧光减弱，相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.01)，Vimentin蛋白荧光及相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；与siRNA空载体+TGF-β2组相比，siRNA-YAP1+TGF-β2组中E-cadherin蛋白荧光增强，相对表达量升高，Vimentin蛋白荧光减弱，相对表达量下降，差异均有统计意义(均P<0.05)(图6，表1)。

图5 不同转染组TGF-β2诱导后HLEB-3细胞中YAP1表达比较 A：细胞免疫荧光染色观察各转染组HLEB-3细胞中YAP1表达 A1：siRNA空载体组 A2：siRNA-YAP1转染组 A3：siRNA空载体+TGF-β2组 A4：siRNA-YAP1+TGF-β2组 B：各转染组HLEB-3细胞中YAP1表达电泳图 C：各转染组HLEB-3细胞中YAP1蛋白和mRNA相对表达量比较 与siRNA空载体组比较，aP<0.05；与siRNA+TGF-β2组比较，bP<0.05(单因素方差分析，LSD-t检验，n=3) C1：YAP1蛋白 C2：YAP1 mRNA 1：siRNA空载体组；2：siRNA-YAP1转染组；3：siRNA空载体+TGF-β2组；4：siRNA-YAP1+TGF-β2组 YAP：Yes相关蛋白；β-actin:β-肌动蛋白Figure 5 Comparison of YAP1 protein expression in HLEB-3 cells among different transfection groups after TGF-β2 induction A:YAP1 expression in HLEB-3 cells of each transfection group by immunofluorescence A1:siRNA empty vector group A2:siRNA-YAP1 transfection group A3:siRNA empty vector+TGF-β2 group A4:siRNA-YAP1+TGF-β2 group B:Electrophoretogram of YAP1 expression in HLEB-3 cells of each transfection group C:Comparison of YAP1 proteins and mRNA in HLEB-3 cells among different transfection groups Compared with the siRNA group,aP<0.05;compared with siRNA+TGF-β2 group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) C1：YAP1 proteins C2:YAP1 mRNA 1:siRNA empty vector group;2:siRNA-YAP1 transfection group;3:siRNA empty vector+TGF-β2 group;4:siRNA-YAP1+TGF-β2 group YAP:Yes-associated protein

图6 不同转染组TGF-β2诱导后HLEB-3细胞中EMT指标蛋白表达比较 A：细胞免疫荧光染色观察各组细胞中E-cadherin、Vimentin蛋白的表达变化(FITC ×200，标尺=50 μm) siRNA-YAP1转染组较siRNA空载体组E-cadherin蛋白荧光增强；siRNA空载体+TGF-β2组较siRNA空载体组E-cadherin蛋白荧光减弱，Vimentin蛋白荧光增强；siRNA-YAP1+TGF-β2组较siRNA-YAP1转染组E-cadherin蛋白荧光减弱；siRNA-YAP1+TGF-β2组较siRNA空载体+TGF-β2组中E-cadherin蛋白荧光增强，Vimentin蛋白荧光减弱。蓝色荧光DAPI核染，绿色荧光标记YAP1蛋白 B：各组细胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表达电泳图 1：siRNA空载体组；2：siRNA-YAP1转染组；3：siRNA空载体+TGF-β2组；4：siRNA-YAP1+TGF-β2组 siRNA:小干扰RNA；YAP：Yes相关蛋白；TGF：转化生长因子；Vimentin：波形蛋白；E-cadherin：E-钙黏蛋白；β-actin:β-肌动蛋白Figure 6 Comparison of EMT marker proteins expression in HLEB-3 cells among various transfection groups after TGF-β2 induction A:E-cadherin and vimentin proteins expression in HLEB-3 cells of each transfection group by immunofluorescence (FITC ×200,bar=50 μm) Compared with siRNA empty vector group,the fluorescence of E-cadherin protein in siRNA-YAP1 transfection group was increased;compared with siRNA empty vector group,the fluorescence of E-cadherin protein in siRNA empty vector+TGF-β2 group was decreased,and the fluorescence of Vimentin protein was enhanced;compared with siRNA-YAP1 transfection group,the fluorescence of E-cadherin protein in siRNA-YAP1+TGF-β2 group was reduced;compared with siRNA empty vector+TGF-β2 group,the fluorescence of E-cadherin protein in siRNA-YAP1 transfection+TGF-β2 group was stronger,and the fluorescence of Vimentin protein was weaker DAPI staining showed nucleus (blue fluorescence);immunofluorescence staining showed florescently labeled YAP protein (green fluorescence) B:Electrophoretogram of E-cadherin,Vimentin protein expression of each group 1:siRNA empty vector group;2:siRNA-YAP1 transfection group;3:siRNA empty vector+TGF-β2 group;4:siRNA-YAP1+TGF-β2 group siRNA：small interfering RNA；YAP:Yes-associated protein;TGF:transforming growth factor

表1 各组细胞内EMT相关标志物蛋白相对表达量比较(mean±SD)Table 1 Comparison of relative expression levels of EMT-related marker proteins among various groups (mean±SD)组别样本量E-cadherin蛋白相对表达量Vimentin蛋白相对表达量siRNA空载体组30.817±0.0370.788±0.018siRNA-YAP1转染组30.987±0.041a0.745±0.017siRNA空载体+TGF-β2组30.560±0.029ab1.005±0.032absiRNA-YAP1+TGF-β2组30.744±0.092bc0.791±0.021cF值20.22552.541P值<0.01<0.01 注:与各自siRNA空载体组比较,aP<0.05;与各自siRNA-YAP1转染组比较,bP<0.01;与各自siRNA空载体+TGF-β2比较,cP<0.01(单因素方差分析,LSD-t检验) EMT:上皮-间质转化;siRNA:小干扰RNA;YAP:Yes相关蛋白;TGF:转化生长因子;E-cadherin:E-钙黏蛋白;Vimentin:波形蛋白 Note:Compared with the respective siRNA empty vector groups,aP<0.05;compared with the respective siRNA-YAP1 transfection groups,bP<0.01;compared with the respective siRNA empty vector+TGF-β2 group,cP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test) EMT:epi-thelial-mesenchymal transition;siRNA:small interfering RNA;YAP:Yes-associated protein;TGF:transforming growth factor

3 讨论

EMT是指上皮细胞通过某些特定的程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，发生EMT时，间充质细胞标志性蛋白Vimentin、N-cadherin的表达上调，而上皮细胞的标志物E-cadherin表达则下调或缺失[13]。LECs的EMT是指LECs从上皮样细胞向肌成纤维细胞转变的分化过程，形态学上表现为多边形的LECs伸展延长为梭形，呈成纤维细胞样改变；组织学上表现为Vimentin、α-平滑肌肌动蛋白表达增加，同时伴有纤维连接蛋白、层黏连蛋白等其他肌成纤维细胞固有成分的表达，以及LECs的表达成分，如α晶状体蛋白、E-cadherin等的表达量降低或丢失[1]。LECs发生EMT等一系列病理过程后具有较强的收缩性，常引起晶状体囊膜皱缩而失去透明性，最终导致严重的视力障碍，是PCO发生和发展的主要病理机制[14]。本研究中结果显示，HLEB-3细胞经TGF-β2诱导后E-cadherin蛋白表达减少，Vimentin蛋白表达增加，证明HLEB-3细胞的EMT模型诱导成功。

Hippo信号通路最初在果蝇中被发现，其能够调控细胞增生、凋亡、分化等活动，从而控制器官大小和组织发育稳态[15]。YAP和具有PDZ结合域的转录共激活因子是Hippo通路的2个主要下游效应因子[16]。YAP是一种原癌基因，激活后其表达促进细胞发生EMT，抑制细胞凋亡，促进细胞增生[17]。有研究发现YAP参与肝癌细胞及房室内皮细胞发生EMT过程[18-19]。Song等[11]条件性敲除小鼠YAP基因发现晶状体严重发育迟缓和畸形，主要特征是晶状体整体明显缩小，LECs丢失，纤维细胞排列紊乱，形成空泡，说明YAP蛋白参与晶状体的正常发育和维持，与白内障的发生有关。该研究还发现细胞间黏附减少的LECs内核YAP表达增加，推测在PCO形成过程中YAP活性增加[11]。

本研究发现，TGF-β2诱导HLEB-3细胞发生EMT后细胞内YAP1表达增加，说明YAP1可能参与LECs发生EMT的过程，可能是PCO进展的标志。无论是正常的HLEB-3细胞或是经TGF-β2诱导EMT的HLEB-3细胞，转染特异性siRNA-YAP1可以下调细胞内YAP1的表达，不影响正常培养细胞的Vimentin表达，但正常培养细胞的E-cadherin表达上调，可增加细胞的黏附性，降低其发生EMT的概率；在TGF-β2组细胞内下调YAP1则E-cadherin表达明显上调，Vimentin表达明显下调，说明siRNA-YAP1可明显抑制由TGF-β2诱导的HLEB-3细胞发生EMT。以上结果表明Hippo/YAP1与LECs表型转换及纤维化之间存在一定的关系，YAP1表达下调可抑制由TGF-β2诱导的HLEB-3细胞EMT过程，从而为预防PCO的发展提供新的思路。

YAP1是一种基本原癌基因，与肿瘤细胞EMT的相关研究已有较多报道，在肝细胞癌中可观察到YAP1反复扩增[20]。此外，YAP1还有乳腺上皮细胞、胰腺癌细胞的EMT和转移潜能[17,21]。YAP1进入细胞核后激活靶转录因子，促进基因表达、致癌转化和EMT[10]。本研究结果显示，Hippo/YAP1参与LECs发生EMT的过程调控，siRNA-YAP1可抑制由TGF-β2诱导的HLEB-3细胞的EMT，由于EMT是PCO发生的关键过程，进而推测siRNA-YAP1可能延缓或阻止PCO的发生。未来的研究将进一步探索Hippo/YAP1通路的上下游调控网络，为预防PCO提供新的治疗靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在任何利益冲突

作者贡献声明郑柳、胡超：实验操作、论文撰写；杨彬彬、杨兴刚：数据整理、统计分析；丁芝祥：论文修改、经费支持