蛇床子素对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及其机制

姜习凤 李光飞 曹国文

骨肉瘤在儿童和年轻人中是最常见的原发性恶性肿瘤，具有恶性程度高，疾病进展迅速的特点[1]。骨肉瘤起源于间充质细胞，其病理特征是梭形细胞和异常的骨样形成。尽管手术、辅助化疗、放疗等诸多手段用来治疗骨肉瘤，然而骨肉瘤的预后仍然不太理想，局部病灶患者的5 a生存率约为60%～80%，而转移型患者的生存率则低至15%～30%，并且肺转移是导致骨肉瘤患者死亡的最常见原因[2]。目前用于人类骨肉瘤治疗的化疗方案涉及多种化疗剂的组合，如高剂量甲氨蝶呤与亚叶酸钙、多柔比星、顺铂与异环磷酰胺、依托泊苷等等。这些方案在骨肉瘤的化疗中发挥了重要作用，但对生存率没有明显的改善[3]，因此研制高效低毒的抗骨肉瘤药物仍然是当前骨肉瘤研究的热点和难点。

在新型抗肿瘤药物的研究中，天然产物已获得相当多的关注。蛇床子素(Osthole)作为中药蛇床子中含量最高的香豆素类化合物，已有报道显示其对心脑血管系统、中枢神经系统、内分泌系统、免疫系统等具有良好的作用，并能以剂量依赖性抑制人胆囊癌、三阴性乳腺癌等肿瘤细胞的增殖、迁移，诱导凋亡[4-5]。现有研究表明蛇床子素能诱导骨肉瘤细胞发生凋亡[6]，但尚未阐明蛇床子素在骨肉瘤侵袭和迁移过程中的作用及其潜在作用机制，因此本研究拟初步探索蛇床子素对骨肉瘤增殖、迁移和侵袭的抑制作用及其潜在的生物学机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人骨肉瘤细胞U2-OS为本实验室保存，培养于DMEM(高糖)培养基。置培养箱内5% CO2、37 ℃下常规培养，2 d换液1次，3～4 d传代1次。

1.2 主要实验药品和试剂

蛇床子素购于上海诗丹德生物公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。DMEM(高糖)培养基购自HyClone公司；胎牛血清购自GIBCO公司；胰酶(Trypsin)购自BIOSHARP公司；瑞-姬氏染液购自南京建成科技有限公司；M-per蛋白裂解液、ECL发光液购自美国Thermo公司；MTT试剂盒购自上海碧云天生物公司；Transwell小室购自美国Corning公司；PTEN、pAKT、AKT和GAPDH抗体购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1细胞增殖实验 96孔板中每孔接种合适数量的人骨肉瘤细胞U2-OS，培养24 h后更换新鲜培养液，同时分别加入不同浓度(20～200 μmol/L)的蛇床子素，对照组加入含0.2% DMSO的培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养。培养44 h后，以10 μL/孔加入MTT试剂，继续培养4 h后每孔加入DMSO 100 μL充分振荡使结晶充分溶解。在酶标仪上测定荧光OD 570 nm的吸光度值，并按照文献报道的方法[7]计算出抑制率和半数抑制浓度，实验独立重复3次。

1.3.2克隆形成实验 消化U2-OS细胞，以细胞密度1 000个/孔接种于6孔板内，十字法使其均匀分布，待24 h细胞贴壁后，对照组加入含0.2% DMSO的培养基，实验组加入含160 μmol/L蛇床子素的DMEM培养基，作用24 h后全部换成DMEM完全培养基继续培养10 d，每2 d更换1次培养基。当培养基中出现肉眼可见克隆且显微镜下可见单个克隆集落细胞计数大于50时，终止培养，弃去培养液，PBS洗2次后，4%多聚甲醛固定细胞10 min，用瑞-姬氏染液进行染色，蒸馏水洗净干燥后倒置显微镜拍照观察计数，实验独立重复3次。

1.3.3细胞划痕实验 取对数生长期的U2-OS细胞种于6孔板中，待细胞密度达到80%左右时，用无菌的200 μL枪头垂直于板底直线划痕，PBS清洗3遍后加入含不同浓度蛇床子素的无血清DMEM培养基继续培养，于0 h及24 h取样拍照，记录各组细胞划痕宽度，实验独立重复3次。

1.3.4细胞侵袭实验 将Matrigel基质胶置于冰上，用无血清DMEM培养基以1∶7稀释，取25 μL加入Transwell上室膜上铺平，37 ℃培养箱静置30 min待其凝固，使用前先用无血清培养基浸润上室膜。在各组U2-OS细胞培养48 h后消化离心，用无血清培养基重悬并计数，分别加入1×105个细胞，下室加入DMEM完全培养基。孵育24 h后，用棉签擦去小室内表面未迁移的细胞，PBS洗3次，瑞-姬氏染液染色，风干后用中性树脂封片显微镜拍照，实验独立重复3次。

1.3.5Western Blot法检测蛋白表达 将U2-OS细胞以2×105个/孔密度接种于6孔板，待细胞密度到达80%后给药，加入不同浓度的蛇床子素作用，48 h后弃去培养基，PBS洗3次，加入M-per蛋白裂解液，冰上裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min下离心15 min去上清，用BCA法测定蛋白浓度并调平，加入上样缓冲液于95 ℃变形3～5 min。10%聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳后，电转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭后孵育一抗4 ℃过夜，TBST洗膜3次，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL显像后于暗室曝光。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 蛇床子素对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖的作用

用0、20、40、80、120、160、200 μmol/L浓度的蛇床子素作用于人骨肉瘤U2-OS细胞48 h后，MTT结果如图1和表1所示，随着剂量的增加，蛇床子素对U2-OS细胞活力的抑制作用逐渐增强，说明蛇床子素抑制骨肉瘤的作用具有剂量依赖性，48 h的半数抑制浓度为97.084 μmol/L。

图1 蛇床子素对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖的作用(MTT方法，**与0 μmol/L组相比，P<0.01)

表1 不同浓度蛇床子素处理后对人U2-OS增殖的影响

2.2 蛇床子素对人骨肉瘤细胞U2-OS克隆形成的作用

不同浓度的蛇床子素作用后，细胞平板克隆形成率较对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，且随着蛇床子素浓度的升高，U2-OS细胞平板克隆形成率逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 蛇床子素对人骨肉瘤细胞U2-OS克隆形成的作用(**与0 μmol/L组相比，P<0.01)

2.3 蛇床子素对人骨肉瘤细胞U2-OS迁移的作用

通过比较对照组和给药组细胞伤口愈合程度来判断迁移能力，以0 h作为对照，在24 h分别观察其迁移情况(如图3a所示)，160 μmol/L的蛇床子素能显著抑制细胞U2-OS的迁移，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3b。

图3 蛇床子素对人骨肉瘤细胞U2-OS迁移的作用

2.4 蛇床子素对人骨肉瘤细胞U2-OS侵袭的作用

与对照组相比，高浓度的蛇床子素作用U2-OS细胞48 h后，穿膜细胞数明显减少，侵袭受到显著抑制，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

图4 蛇床子素对人骨肉瘤细胞U2-OS侵袭的作用

2.5 蛇床子素对U2-OS细胞PTEN/AKT信号通路的作用

为进一步验证蛇床子素对骨肉瘤细胞U2-OS增殖和迁移的抑制作用，采用Western Blot方法检测了相关信号通路蛋白的表达情况。与0 μmol/L组相比，不同浓度的蛇床子素作用后，细胞内PTEN蛋白表达水平显著上升，高浓度组上升最为明显；pAKT的表达水平显著下降，高浓度组下降最为明显，见图5和表2。

表2 蛇床子素对PTEN、pAKT和AKT蛋白表达的作用

图5 蛇床子素对PTEN/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤。虽然骨肉瘤是一种对某些化疗药物具有敏感性的肿瘤，但癌细胞可能会产生耐药性，并有远处转移的趋势，主要是在肺部。转移与侵袭是恶性肿瘤疗效欠佳、预后较差的主要原因，直接导致肿瘤患者死亡。因此，寻求高疗效、低毒性、抑制肿瘤细胞侵袭转移的药物具有极其重要的临床意义。蛇床子素是从蛇床子等植物中提取出来的香豆素类化合物，具有促进肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞周期阻滞、抑制肿瘤转移等多种抗肿瘤作用[8]。研究表明，蛇床子素通过激活Wnt/β-catenin信号通路抑制神经细胞凋亡，促进大鼠运动功能恢复[9]。Abosharaf等[10]利用不同浓度的蛇床子素作用人肺腺癌细胞A549后发现，蛇床子素可以通过抑制组蛋白去乙酰化酶来诱导细胞凋亡。本研究检测了不同浓度的蛇床子素对人骨肉瘤U2-OS细胞增殖、迁移和侵袭的作用，发现蛇床子素能有效地抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，为蛇床子素的深入研究和抗癌药物研发提供了理论依据。

骨肉瘤是一种遗传性不稳定的实体肿瘤，核型高度复杂，染色体结构变异和拷贝数变化频率高，在这些基因组的改变中，磷酸酶和紧张素同源基因(PTEN)是最常见的改变基因之一[11]。PTEN是一种重要的肿瘤抑制因子，其蛋白产物具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶的活性，可以通过去磷酸化参与细胞调控。在体内和体外，PTEN特异性剪切PIP3磷酸盐，PTEN是PI3K/Akt信号通路的主要负调控因子，在多种人类肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥重要的作用[12]。有报道称在转染miR-92a的骨肉瘤细胞中，过表达 PTEN可增加G0/G1期细胞的数量，并诱导细胞程序性死亡[13]。此外，PTEN还可以增加BAD的磷酸化或过表达AKT相关的凋亡蛋白来促进骨肉瘤细胞的凋亡抑制其增殖。PTEN在阻止骨肉瘤细胞转移的过程中也发挥着重要作用。上皮-间充质转化(EMT)被认为是侵袭-转移级联反应的初始过程，因为它赋予癌细胞迁移和侵袭的特性。研究表明引入PTEN基因后β-catenin及波形蛋白的表达量极大地下调，E-cadherin的表达上调，表明PTEN可以部分地抑制骨肉瘤细胞HOS58的EMT进程[14]。此外，上调PTEN的表达还会减少AKT的磷酸化，提示PTEN可能通过AKT通路抑制EMT从而抑制细胞的迁移和侵袭。利用Western Blot法检测PTEN、pAKT和AKT的蛋白的表达水平，结果显示蛇床子素处理人骨肉瘤细胞U-2OS后，随着蛇床子素剂量的增加，U-2OS细胞中PTEN蛋白的条带逐渐变亮，而pAKT蛋白的条带逐渐变浅，可见其能浓度依赖性地上调U-2OS细胞中PTEN蛋白的表达且下调pAKT蛋白的表达。因此，笔者推测蛇床子素能够通过调控PTEN-AKT通路来抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述，本研究发现蛇床子素不仅可以抑制骨肉瘤的增殖，还通过调控PTEN-AKT通路达到较好地抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用，对转移性骨肉瘤的治疗具有潜在的应用前景。