内蒙古地区捻转血矛线虫阿苯达唑耐药种群Ⅰ型β微管蛋白基因单核苷酸多态性调查

苏 倩，翟 帅，孙 柯，林 洋，王腾宇，呼和巴特尔，王文龙

(内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特 010018)

捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)属于毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)。寄生于反刍动物消化道的圆线虫大多数为毛圆科，而捻转血矛线虫是其中致病力最强的一种[1]。捻转血矛线虫主要以吸食宿主血液为生，导致宿主贫血、消瘦、皱胃黏膜损伤等[2]，严重者可导致宿主，尤其是幼龄宿主死亡。目前捻转血矛线虫病呈世界性分布，尤其是热带、亚热带及降雨量较多地区[3]。对于该病的治疗，目前主要依赖于阿苯达唑、伊维菌素、左旋咪唑等驱虫药物[4]。而阿苯达唑作为一种广谱、高效、低毒的苯并咪唑类抗蠕虫药物，在国内外均得到了广泛的应用[5]。但因为多年的药物使用不当导致这些寄生性线虫产生耐药性，即便是英国、荷兰、西班牙、瑞士、德国、波兰、意大利、法国、丹麦、瑞典和挪威等[6]一些欧洲国家也深受其害，这在一定程度上给养殖业带来严重威胁，导致巨大的经济损失。根据国内外报道发现，阿苯达唑产生耐药性的主要原因是捻转血矛线虫的Ⅰ型β微管蛋白(isotype-Ⅰ β-tubulin gene)基因的3个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(F167Y，E198A和 F200Y)[7-9]，即167位点由苯丙氨酸突变为络氨酸(TTC-TAC)，198位点由谷氨酸突变为丙氨酸(GAA-GCA)，200位点由苯丙氨酸突变为络氨酸(TTC-TAC)。众所周知，内蒙古自治区是中国最大的草原牧区和重要的畜牧业生产基地，掌握内蒙古地区捻转血矛线虫阿苯达唑耐药情况，对捻转血矛线虫病的防控来说至关重要，因此，本实验室一直在内蒙古地区展开捻转血矛线虫耐药性调查[10]，本试验选取耐药虫株，对其种群阿苯达唑耐药性Ⅰ型β-tubulin基因进行单核苷酸多态性调查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品虫株 捻转血矛线虫虫株采自于内蒙古鄂尔多斯市乌审旗、乌兰察布市察右后旗和兴安盟科右前旗，根据雌虫和雄虫的形态特征，体视显微镜下鉴定后分装到冻存管中，标记好后存入液氮中。

1.1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒，天根生化科技公司产品；PCR扩增用试剂，TaKaRa公司产品；DNA Marker，北京全式金生物技术有限公司产品；琼脂糖，BIOWEST公司产品。

1.1.3 主要仪器 PCR仪(PowerCycler384)、水平凝胶电泳仪(BG-subMIDI)，北京百晶生物技术公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据杨新[11]的方法，由北京六合华大基因科技有限公司分别合成针对捻转血矛线虫核糖体第二内转录间隔基因(ITS-2)序列和Ⅰ型β-tubulin基因序列的特异性引物，上、下游引物序列见表1。

表1 ITS-2和Ⅰ型β-tubulin基因引物序列

1.2.2 虫体基因组DNA提取 分别取鄂尔多斯市乌审旗、乌兰察布市察右后旗和兴安盟科右前旗3个地区各19条捻转血矛线虫雄虫，按照DNA提取试剂盒说明书步骤提取DNA。

1.2.3 捻转血矛线虫ITS-2基因扩增鉴定 PCR扩增反应体系为25 μL：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaqTM12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；然后94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸 30 s，共 35个循环；最后72℃延伸7 min。将PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.4 捻转血矛线虫Ⅰ型β-tubulin基因扩增 PCR扩增反应体系为25 μL：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaqTM12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；然后94℃变性40 s，53℃退火40 s，68℃延伸 40 s，共40个循环；最后68℃延伸7 min。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.5 测序分析 将捻转血矛线虫Ⅰ型β-tubulin基因扩增产物送北京六合华大基因科技有限公司进行双向测序，分析测序结果。

2 结果

2.1 捻转血矛线虫ITS-2基因扩增

PCR扩增后，3个地区虫样电泳结果显示(图1)，扩增出大小约265 bp的条带，与ITS-2基因预期大小一致，证明这3个地区各自的19条雄虫样品均为捻转血矛线虫，可以用作后续试验使用。

M.DNA标准DL 2 000；1～19.样品ITS-2基因PCR产物；20.阳性对照；21.阴性对照

2.2 捻转血矛线虫Ⅰ型β-tubulin基因扩增

PCR扩增后，电泳结果显示(图2)，3个地区57条捻转血矛线虫雄虫DNA样本均扩增出大小约385 bp的条带，与Ⅰ型β-tubulin基因基因预期大小一致，扩增产物可以用于后续测序分析。

M.DNA标准DL 2 000；1～19.样品Ⅰ型β-tubulin基因PCR产物；20.阳性对照；21.阴性对照

2.3 测序结果分析

对内蒙古3个地区57条捻转血矛线虫雄虫Ⅰ型β-tubulin基因PCR产物进行测序，经Chromas软件统计分析基因序列峰图后，显示内蒙古3个地区57条捻转血矛线虫雄虫Ⅰ型β-tubulin基因167位点均未发生突变，全部为纯合敏感型。而198位点，乌审旗有1条(5.26%)为纯合耐药型，2条(10.53%)为杂合耐药型，16条(84.21%)为纯合耐药型；200位点，乌审旗有16条(84.21%)为纯合敏感型，2条(10.53%)为杂合耐药型，1条(5.26%)为纯合耐药型，见表2。察右后旗198位点有8条(42.10%)为纯合敏感型，5条(26.32%)为杂合耐药型，6条(31.58%)为纯合耐药型；200位点有6条(31.58%)为纯合敏感型，11条(57.89%)为杂合耐药型，2条(10.53%)为纯合耐药型，见表3。科右前旗有198位点有1条(5.26%)为纯合敏感型，18条(94.74%)为纯合耐药型；200位点有18条(94.74%)为纯合敏感型，1条(5.26%)为杂合耐药型，见表4。综合分析这3个地区捻转血矛线虫雄虫Ⅰ型β-tubulin基因序列发现有4种基因型，分别是198纯合耐药型及200纯合敏感型：乌审旗16条84.21%，察右后旗6条31.58%，科右前旗18条94.74%。198纯合敏感型及200纯合耐药型：乌审旗1条5.26%，察右后旗2条10.53%。198纯合敏感型及200杂合耐药型：察右后旗6条31.58%，科右前旗1条5.26%。198及200均杂合耐药型：乌审旗2条10.53%，察右后旗5条26.32%，见表5。

表2 内蒙古鄂尔多斯市乌审旗Ⅰ型β-tubulin基因3个位点单核苷酸多态性

表3 内蒙古乌兰察布市察右后旗Ⅰ型β-tubulin基因3个位点单核苷酸多态性

表4 内蒙古兴安盟科右前旗Ⅰ型β-tubulin基因3个位点单核苷酸多态性

表5 内蒙古地区捻转血矛线虫Ⅰ型β-tubulin基因的基因型及其频率

3 讨论

阿苯达唑在1976年被美国SmithKline & Beecham公司研制开发，1977年首次应用，中国兽药监察所在1979年开发成功，1981年试生产后，到现在这几十年来，广泛应用于国内畜禽蠕虫病临床防治，在一定程度上促进了我国畜牧行业的发展[5]。但根据国外Kotze等对某一类药物产生耐药性的物种首次被报道时间的统计与药物研发时间对比发现，在大多数情况下，耐药性是在每个药物组引入后的10年内出现的[13]。所以目前国内外捻转血矛线虫耐药性的问题日趋严重。

本试验对内蒙古乌审旗、察右后旗和科右前旗3个地区捻转血矛线虫阿苯达唑耐药种群Ⅰ型β-tubulin基因3个单核苷酸多态性位点进行了调查，结果发现3个地区167位点均未发生突变，这也与国内其他地区的调查结果相一致[14-15]，而198和200位点则有突变，总体上看198位点突变频率高于200位点。但据国外报道，检测到167、200位点突变频率高，198位点未发生突变[16]。这说明地区不同，3个位点发生突变的频率也不相同。分析这57条雄虫基因序列发现4种基因型，分别是198纯合耐药型及200纯合敏感型、198纯合敏感型及200纯合耐药型、198纯合敏感型及200杂合耐药型和198及200均杂合耐药型。Barrere等报道当10%的个体具有抗性基因型(TAC/TAC200、TAC/TAC167或TTC/TAC167、TAC/TTC200)时，一个种群被认为是耐药的。但由于文献中没有描述耐药的阈值，所以10%的阈值是任意选择的。当在一个特定农场估计的耐药捻转血矛线虫的比例超过这一阈值时，假定该特定农场的捻转血矛线虫为阿苯达唑耐药型[9]。耐药基因型频率乌审旗为100%，察右后旗68.42%，科右前旗94.74%，这已经大大地超过了10%，表明这3个地区捻转血矛线虫对阿苯达唑耐药性严重。额叶勒德格在2018年通过对乌审旗地区绵羊主要蠕虫病流行病学及驱虫效果调查研究，表明该地区捻转血矛线虫感染率较高，且为优势虫种，对丙硫咪唑产生了严重的耐药性[17]。赵学亮等[18]2018年通过粪便虫卵减少试验对乌兰察布市察右后旗羊场调查发现，也存在耐药性，这表明与国际公认的粪便虫卵减少试验(FECRT)结果一致，说明Ⅰ型β-tubulin基因3个位点单核苷酸多态性检测方法可靠。Barrere等也认为这是一个检测苯并咪唑类耐药性比较有效的方法，而且可以在捻转血矛线虫低感染量时检测出其耐药情况，以便提前隔离治疗。本研究结果为捻转血矛线虫病的预防和治疗提供了新思路，可有效避免或减缓捻转血矛线虫耐药性的产生，进一步推动养羊产业疾病防控的发展，为养殖户减少一定的经济损失。