马齿苋醇提物体外生物学活性测定

葛 翎，路 露，周 谦，张秋生，蔡 波，黄晓德，张峰伦，钱 雪，李海涛*，陈 斌*，曹 鹏

(1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023； 2. 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 211100；3. 南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028； 4. 广州栋方生物科技股份有限公司，广东 广州 510800；5. 广州奥蓓斯化妆品有限公司，广东 广州 510800)

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)，又名马舌菜、长命菜，是中国卫生部和世界卫生组织指定的天然药食同源物[1]，常以根茎入药。马齿苋对气候、土壤等生存环境条件适应性极强，几乎可以在任何土壤上生存[2]。研究表明其具有抗炎[3]、抗肿瘤[4]、抗氧化[5]等多种生物学活性，在临床上常用于痢疾、肠炎治疗。这些功效及活性主要与其含有丰富的黄酮类、多糖类、生物碱类物质有关[6-7]。

目前，马齿苋资源的利用仅限食用及简单药用，而其实用价值研究主要集中在植物培养环境优化[8]、提取工艺改进[9]及多糖类和生物碱类成分抗肿瘤、抗氧化机制研究[10]等方面，而在抗敏、修复肌肤屏障、降脂、降糖等方面研究较少，并且甚少涉及资源开发及产品应用。同时，相关研究表明马齿苋水提物能够通过作用于血管内皮的α-受体，抑制毛细血管通透性，减轻炎症反应，缓解过敏症状，加速上皮细胞的生理功能恢复，促进溃疡的修复、愈合[11-12]，可以作为一种抗敏修复药应用在皮肤病治疗中。动物试验[13]表明马齿苋能够改善高脂血症，防止脂质沉积，调节脂质代谢。因此，本试验通过对马齿苋醇提物(PortulacaoleraceaL. ethanol extract，POEE)进行安全性、生物活性评价，以期为其在医药、护肤品行业深层次应用提供数据支撑并为该领域提供天然的植物原料。

1 试剂与仪器

1.1 试验材料

马齿苋(中国北京同仁堂有限公司)；大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)均由南京野生植物综合利用研究院提供。

1.2 试剂

透明质酸酶、酪氨酸酶(Aladdin试剂有限公司)；α-葡萄糖苷酶(上海瑞永生物科技有限公司)；氢氧化钠、无水氯化钙、无水乙酸钠、冰乙酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等(国药集团化学试剂有限公司)；L-左旋多巴(美国Abcam公司)；透明质酸钠(华熙福瑞达生物医药有限公司)；对二甲氨基苯甲醛(上海Macklin科技有限公司)。

1.3 试验仪器

722E型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；HZQ-F160型全温度震荡培养箱(太仓华美生化仪器厂)；DFT-1000型高速万能打粉机(温岭市林大机械有限公司)；HH-6型数显恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司)；BSA224S型电子分析天平(北京楚齐仪表有限责任公司)。

2 试验方法

2.1 马齿苋醇提液制备工艺

用高速粉碎机将马齿苋药材进行粉碎，过40目筛，最后将过完筛的马齿苋粉末置于干燥器中密封保存，备用。

称取马齿苋粉末100 g，料液比1:15(g/mL)，提取温度为50℃，乙醇浓度为70%，时间为53 min，后过滤，滤液旋蒸至一定体积，并干燥至恒重，得到马齿苋醇提物，按试验所需质量浓度配置成一定质量体积浓度的醇提取物溶液[14-15]。

2.2 最小抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)测定

参考王玲等[16]的方法，采用试管倍比稀释法测定最小抑菌浓度(Minimal inhibition concentration，MIC)，用二甲亚砜将样品稀释成200、100、50、25、12.5、6.25 mg·mL-1溶液备用。取1 mL液体培养基、500 μL不同浓度样品和500 μL菌悬液(1×108CFU/mL)，加入到试管中，充分混匀。试管置于37℃，180 r·min-1摇床培养24 h。以含有二甲亚砜的液体培养基和菌液的试管为阴性对照。观测其MIC值，平行试验3次，取平均值。确定MIC后，测定最小杀菌浓度(Minimal fungicidal concentration，MBC)[17]，将有效抑菌浓度药液移种、均匀涂布至空白的马铃薯固体培养基上，将培养皿放置在37℃，180 r·min-1摇床培养24 h。观察培养基上有无菌体生长，以培养皿中计数减少原始菌落的99.9%的马齿苋醇提物的浓度为最小杀菌浓度。平行试验3次，取平均值。

2.3 透明质酸酶抑制试验

对Elson-Morgan法进行改进、测定[18-19]，配置质量浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg·mL-1POEE。取0.25 mmol·L-1CaCl2溶液0.1 mL和0.5 mL透明质酸酶37℃水浴锅保温20 min；取出后每组加入POEE 0.5 mL，继续37℃保温20 min；加入0.5 mL透明质酸钠液37℃水浴锅保温40 min，常温放置10 min；每组加入0.4 mol·L-1NaOH 0.1 mL溶液和0.5 mL乙酰丙酮(现配)溶液，置于沸水浴中加热15 min后取出，立即用冰水进行冷却15 min；加入埃尔利希试剂1.0 mL，经充分振荡后加入无水乙醇至8.0 mL，室温放置20 min显色，并用分光光度计于波长530 nm处测定其吸光值。将扑尔敏作为阳性对照品，进行对照试验。

式中：A为对照溶液Abs值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)；B为对照空白Abs值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)；C为试样溶液Abs值；D为试样空白溶液Abs值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)。

2.4 酪氨酸酶抑制率测试

参考刘晓英等[20]、严航等[21]方法改进，取马齿苋醇提物溶于磷酸盐缓冲液(pH=7)，稀释成不同质量浓度的POEE，按照表1设计向试管中依次分别加入PBS、POEE和酪氨酸酶溶液(100 U/mL)，混合均匀，置于37℃水浴恒温反应10 min，分别迅速加入0.5 mL L-左旋多巴溶液(1.5 mmol/L)，混合均匀，反应15 min，在475 nm处测定吸光值(A)，各反应组吸光值分别记作A1、A2、A3和A4，并设置熊果苷为对照。按照以下公式计算马齿苋样品液对酪氨酸酶的抑制率:

表1 各反应液组成Table 1 Reaction liquid composition

2.5 α-葡萄糖苷酶抑制试验

参考杨晓军等[22]、姜翠翠等[23]的方法进行改动，测定样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。分为样品组、样品对照组、阴性对照组、阴性空白对照组，POEE的浓度分别为20、40、60、80、100、200 mg·mL-1，加入的试剂按表2操作。加入不同浓度POEE与α-葡萄糖苷酶，37℃恒温孵育15 min，再加入对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷(P-nitrophenol glucopyranoside,PNPG)(1 mmol·L-1)37℃恒温继续孵育20 min后，最后加入100 μL Na2CO3(1 mol·L-1)终止液终止反应。在405 nm波长处测定吸光度，每组重复3次，同时以不同浓度阿卡波糖溶液作为阳性对照。对α-葡萄糖苷酶的抑制率按照以下公式进行计算。

式中：As为样品组吸光值；Asc为样品对照组吸光值；Ac为阴性对照组吸光值；Abc为阴性空白对照组吸光值。

2.6 马齿苋醇提液安全性评价及降脂活性检测

2.6.1 马齿苋醇提液对动脉粥样硬化细胞模型

Raw 264.7细胞活力的影响

参考李秀英等[24]方法，略有改动。0～200 μg·mL-1ox-LDL诱导Raw 264.7细胞成为泡沫细胞，用MTT法测定细胞增殖活性；利用ox-LDL建立动脉粥样硬化Raw 264.7细胞模型，加入不同浓度的POEE进行干预，用MTT法测定细胞增殖活性。并设立正常药液组(只加入不同浓度POEE)，以观察不同浓度药液对Raw 264.7细胞的影响。

表2 马齿苋醇提物对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定的加样表Table 2 Sample of the determination of α-glucosidase inhibitory activity by the POEE (μL)

2.6.2 马齿苋醇提物对Raw 264.7细胞动脉粥硬

化模型中胞内TC和FC含量的影响

设置空白对照组、模型组、马齿苋醇提物药液组。适应性培养24 h后，换成无血清细胞培养液，适应性培养1 h。马齿苋醇提物药液组加入不同浓度药液，使其终浓度分别为400、300、200、100 μg·mL-1(A～D组)，培养4 h后，加入造模所用ox-LDL使其终浓度为60 μg·mL-1。经过24 h孵育，用0.25%含二胺四乙酸胰蛋白酶消化液消化后收集细胞，按照脂质测定试剂盒说明书分别检测细胞内TC和FC含量。以80 μg·mL-1苯扎贝特为阳性对照组，每组重复4次。

3 结果与分析

3.1 最小抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)测定结果

POEE对5种菌的MIC和MBC的测定结果见表3和表4。POEE对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制效果(表3)。POEE浓度为50 mg·mL-1时，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌不生长，而金黄色葡萄球菌在浓度为100 mg·mL-1时不生长。由表可知POEE对白色念珠菌抑制效果最佳，其MIC和MBC 值分别为50、100 mg·mL-1, 对金黄色葡萄球菌抑制效果最差，MIC和MBC 值分别为100、100 mg·mL-1。

3.2 马齿苋醇提物透明质酸酶体外抑制试验结果

如图1所示，POEE对透明质酸酶的抑制率随着浓度的增大而增大，呈浓度依赖型增长。30 μg·mL-1阳性对照扑尔敏对透明质酸酶抑制率为80%，10 mg·mL-1POEE可达到80%，由此可知POEE具有显著的抗敏活性。

表3 最小抑菌浓度结果Table 3 Results of minimum inhibitory concentration

表4 马齿苋醇提物对5种菌种的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度Table 4 Minimum inhibitory concentration and minimumbactericidal concentration of the POEE against 5 species of bacteria

图1 透明质酸酶抑制结果Fig. 1 Hyaluronidase inhibition rates of the POEE

3.3 酪氨酸酶抑制率测试结果

由表5可知，在2.5～20 mg·mL-1浓度范围内，POEE和熊果苷对酪氨酸酶的抑制率成正比。当POEE浓度为20 mg·mL-1时，对酪氨酸酶的抑制率高达76.71%，其抑制率是同等浓度熊果苷的1.25倍。表明马齿苋可以成为一种有效且对人体无毒副作用的天然酪氨酸酶抑制剂。

表5 马齿苋醇提物对酪氨酸酶的抑制效果Table 5 Inhibitory effect of the POEE on tyrosinase

3.4 α-葡萄糖苷酶抑制试验结果

由图2可知，POEE浓度在20～200 mg·mL-1范围内对α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈正相关作用。当其浓度为200 mg·mL-1时，α-葡萄糖苷酶抑制率达49%，其抑制效果接近于阿卡波糖(200 mg·mL-1)，说明马齿苋具有潜在的降糖功效。

3.5 马齿苋醇取物改善动脉粥样硬化相关指标

细胞试验结果如图3所示，与模型组相比，POEE在100～400 μg·mL-1浓度内，对细胞增殖活力无显著影响，具有显著安全性(p<0.05)。在安全给药浓度下，300 μg·mL-1POEE能够最好保护被60 μg·mL-1ox-LDL损伤细胞，提高受损伤细胞增值活力。

图2 不同样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig. 2 Inhibition of α-glucosidase by different samples

图3 不同浓度马齿苋醇提物对泡沫细胞增殖活性的影响及安全性评价Fig.3 The ratio of the POEE with different concentration to the proliferation activity of foam cells and its safety evaluation注：*P<0.05；***P<0.001；****P<0.000 1，下同

如图4所示，表明马POEE能够降低Raw 264.7细胞动脉粥样硬化模型中胞内总胆固醇及游离胆固醇含量，降低细胞内脂质含量，延缓动脉粥样硬化进程，其效果与80 μg·mL-1苯扎贝特没有显著差异(P<0.05)。

4 讨 论

马齿苋醇提物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制效果，这与翟兴礼[25]的研究结果相似。抑菌效果证实与提取物浓度有相关性，但对不同菌种有差异性。其中对白色念珠菌抑制效果最佳，对金黄色葡萄球菌抑制效果最差，这可能是由于其醇提物成分抑制真菌能力较强。谷春梅等[26]研究发现马齿苋提取物中黄酮的抑菌顺序为：酵母菌>黑曲霉>大肠杆菌，这也进一步表明马齿苋提取物对真菌的抑制效果强于细菌。

图4 各组细胞内TC/FC比较Fig. 4 Comparison of TC/FC in each group

目前，在洗护用品检测中常见的的抗过敏试验方法有透明质酸酶体外抑制试验、肥大细胞组胺释放试验、被动皮肤过敏试验和毛细血管通透性试验等[27]。其中，透明质酸酶体外抑制试验是一种与过敏具有强相关性的测定方法。本试验表明POEE对透明质酸酶的抑制呈现出良好的量效关系，这可能是由于醇提物含有黄酮、香豆素、生物碱等非极性物质[28]，这些有效成分对透明质酸酶活性有显著抑制作用。此外，胡一梅[29]的动物试验也证实马齿苋醇提液对急性湿疹具有缓解治疗作用，其机制可能是通过抑制毛细血管通透性，抑制炎性肿胀，从而减轻湿疹局部的瘙痒、水肿症状。由此也验证了马齿苋提取液具有显著的抗敏活性。

酪氨酸酶是普遍存在于人体内对黑色素生物合成过程中起关键作用的酶，抑制酪氨酸酶活性是目前评价植物天然成分美白功效的标准之一[30]。POEE对酪氨酸酶具有明显抑制效果，且呈浓度依赖性，具有美白作用，这与张理平等[31]的研究结果一致。这可能是由于POEE中的酸性成分具有抑制酪氨酸酶活性的作用[32]。其可能作用机制是通过与酪氨酸酶的结合，竞争性占据多巴的结合位点，促进黑色素的分解从而有效地抑制皮肤中酪氨酸酶活性，减少皮肤色素沉积。

在降糖功效研究方面，POEE浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈正相关关系，可竞争性抑制α-葡萄糖苷水解酶。其良好的降糖效果表明可以将其开发成一种天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂。天然产物中的α-葡萄糖苷酶的抑制会影响碳水化合物在小肠上部的吸收，降低糖尿病人餐后高血糖水平，预防因血糖波动引发的心血管疾病等[33]。然而长期服用会引发消化系统紊乱等副作用[34]。因此，需要精确控制产品用量。

血脂过高是导致动脉粥样硬化的重要因素，大量含脂质的泡沫细胞是初期病变的特征性表现。因此，降低细胞内脂质堆积，减轻巨噬细胞泡沫化成为防治动脉粥样硬化的重要手段[35-38]。动物试验[39]结果显示富含不饱和脂肪酸的马齿苋可降低家兔血清中 TC、TG、LDL-C含量，升高HDL- C含量水平，提高机体抗自由基作用，减少丙二醛的形成，从而达到抗动脉粥样硬化形成、预防心血管疾病的作用。POEE对脂质代谢紊乱的调节作用，一方面可能是因为马齿苋含有丰富的ω-3不饱和脂肪酸，其作为一种胆固醇的特殊转运载体，能够将胆固醇转运到血管外周组织代谢，防止过多胆固醇沉积于血管壁内，从而缓解动脉粥样硬化[40]。另一方面，马齿苋含大量抗氧化作用的有效成分，能提高机体抗自由基作用，减少丙二醛的形成，从而逆转动脉粥样硬化形成、预防心血管疾病[41]。

5 结 论

本试验对马齿苋的生物活性进行了测定，结果表明POEE可以作为一种安全无刺激的天然防腐剂添加到化妆品中，从而降低化学抑菌剂和防腐剂在护肤品中的应用。同时，POEE能够减轻或抑制常见致敏源对皮肤的刺激作用、增强皮肤的屏障功能，表现了其在美白和抗过敏方面的功效，可以作为美容产品中美白和抗过敏作用的原料来源。另一方面，POEE对α-葡萄糖苷酶的抑制作用、对动脉粥样硬化细胞模型中泡沫细胞增殖活力及细胞内TC、FC的抑制作用，表明马齿苋在降血糖、降血脂方面具有良好功效，可作为潜在的保健品原料或添加剂。

通过POEE在抑菌、抗敏、美白、降糖、降脂等方面的试验研究，为马齿苋在除食用之外作为一种多功效的原料应用到更广泛领域的应用提供参考。