民族药菠菜子质量标准提高研究

谢 莉 艾买提江·阿依甫别克 徐 鸿 于新兰

新疆维吾尔自治区药品检验研究院，新疆 乌鲁木齐 830054

菠菜来源于藜科菠菜属植物菠菜SpinaciaoleraceaL，为药食同源类植物，别名为波斯菜、赤根菜，系属外来中药资源，一般以其地上部分、果实和根入药，现全国各地均有栽培[1-2]。菠菜子为菠菜的果实，又称菠薐菜子，是维吾尔医常用药材，维吾尔语名为 Palek Urughi。主要用于异常胆液质过剩、热性伤寒、发烧不退、体弱、便秘、热性心痛等疾病[3-4]。目前，菠菜子收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》维吾尔药分册中[5]，但该标准内容简单，仅对菠菜子的性状和显微进行简单描述，质量标准偏低，不足以控制本药材的质量。现有研究报道多为原植物种植方法、组织形态和药理作用等方面[6]，目前国内文献未见有关菠菜子药材质量标准的研究报道。因此，为促进中药民族药产业化发展，推动民族药材标准化提高，故本研究对菠菜子的性状、TLC 鉴别、水分、总灰分、浸出物及含量测定项目进行研究，以期为菠菜子质量标准的提高和完善提供理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津(LC-20AT)高效液相色谱仪，二极管阵列检测器(日本岛津公司)；JA 12002 型电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)；SK7210LHC 型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；成像显微镜(日本 OLYMPUS 公司)；冷冻切片机( Thermo 公司)；GZX-9140MBE 型鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)；DZKW-D-6 型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)；KLZ-UP 型艾柯纯水仪(台湾艾柯，成都康宁试验专用纯水设备厂)。

1.2 试药 乙醇(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司，批号 20171008)；甲酸(分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司，批号 20170703)；甲醇(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司，批号 2018101012)；硅胶 G 薄层板(青岛海洋化工分厂，批号 20170812)；乙腈(Fisher 公司，Lot 18356)；磷酸(天津永晟精细化工有限公司，批号 20160215)β-蜕皮甾酮对照品(批号 H918750)购自于加拿大多伦多 Toronto Research Chemical(TRC) 公司。

菠菜子药材从市场上收集，共计25批，产地分布于新疆和田、安徽亳州、山东临沂、甘肃陇西、河北安国等地，药材基源由新疆维吾尔自治区药品检验研究院苏来曼·哈力克主任药师进行鉴定为圆叶菠菜的果实，样品信息见表1。

表1 菠菜子药材信息表

2 方法与结果

2.1 性状 菠菜子的外形与中药蒺藜科蒺藜TribulusterrestrisL.干燥的果实外形相似，常被人混用[7]，目前常被视为蒺藜的伪品之一。故结合药材实际性状，本文对菠菜子性状进行了规范化的描述。菠菜子呈近或扁圆形，直径 2～4 mm。表面浅绿色或灰白色，略粗糙，侧面有 2～4个纵棱；一端圆形，中部有突起，另一端有稍尖的合点，带有残留的果柄或已脱落；果皮坚硬，种皮深棕色、光滑有光泽，种脐部凹陷，具一环状纵沟；胚乳类白色，粉性。无臭，味淡。如图1所示。

图1 菠菜子性状

2.2 定性鉴别 菠菜子中含有黄酮类、甾体类等活性成分，其中甾体类活性成分分为植物甾醇类和昆虫蜕皮激素等，植物甾醇主要含 α-菠菜甾醇、Δ7-豆甾烯醇、β-谷甾醇、蜕皮甾酮、羟基蜕皮激素等[8-10]，本试验为菠菜子中 β-蜕皮甾酮进行定性鉴别，并对展开剂、显色剂、展开环境等色谱条件进行了考察。

2.2.1 供试品溶液的制备 取本品粉末 3g，加 80% 甲醇 5 mL，超声处理 20 min，静置，取上清液，作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 取β-蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成 1 mL含 0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

1.新疆和田；2.安徽亳州；3.山东临沂；4. β-蜕皮甾酮；5.甘肃陇西；6.河南南阳；7.河北安国图2 菠菜子供试品薄层色谱

2.2.3 薄层色谱条件 分别吸取供试品溶液 10 μL，对照品溶液 5 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，选取三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(8∶2∶0.3∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105 ℃ 加热至斑点显色清晰，日光下检视，如图2所示。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，可用于菠菜子中 β-蜕皮甾酮的鉴别。不同采集地样品色谱基本一致，说明该方法可靠稳定。

2.3 检查 水分和总灰分测定分别参照《中国药典》2015 年版四部通则 0832 (第二法)和 2302 进行试验，检验结果见表 2。根据测定结果可得，样品水分在 5.76%～10.06% 范围内，为 (8.37±1.37)%(n=25)；样品总灰分在 4.27%～5.41% 范围内，为 (4.65±0.27)%(n=25)，在各批次样品测定值的基础上上浮 20%，作为各指标的上限，暂定菠菜子质量标准中水分不得过 11.0%，总灰分不得过 6.0%。

2.4 浸出物 参照《中国药典》 2015 年版四部中“药材和饮片检定通则( 0212 )”项下的浸出物测定法试验。选取稀乙醇为提取溶剂，采用冷浸法提取菠菜子样品中的浸出测定结果见表3。

表2 水分、总灰分测定结果 (n=25)

表3 浸出物测定结果

由上表可知，样品测定值范围为6.65%～13.25%，实测值 (%) 为 (10.12±2.03)%(n=25)，在各批次样品测定值的基础上下浮 20%，作为各指标的下限，暂定菠菜子质量标准中浸出物不得低于 8.0%。

2.5 含量测定[11-14]

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ODS C18 (250 mm×4. 6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.02% 磷酸溶液(16∶84)，流速：1.0 mL·min-1，检测波长：250 nm；柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

2.5.2 对照品储备液的制备 精密称取 β-蜕皮甾酮对照品 25.81 mg，置 20 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，定容，即得。

2.5.3 供试品溶液的制备 取菠菜子药材粉末约 1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 80% 甲醇 25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率 250 W，频率 40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用 80% 甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。除加样品外以同法操作，制得空白溶液。结果如图 3所示。

图3 高效液相色谱图

2.5.4 线性关系 从对照品储备液中精密量取各溶液0.5 mL、1.0 mL、1.0 mL、2.0 mL和1.0 mL，分别置于 50 mL、50 mL、25 mL、25 mL和10 mL 量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，依法测定，以溶液浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程：Y=14404×C-28065，r=0.9991。结果表明 β-蜕皮甾酮在 0.1290～1.2905 μg·mL-1(n=2) 范围内呈现良好的线性关系。

2.5.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在制备 0、2、4、6、8、12、14、18、24 和 32 h后，进样测定，测得 β-蜕皮甾酮含量的平均值为0.12%，RSD 为 0.78%。表明供试品溶液在室温放置 32 h内基本稳定。

2.5.6 加样回收 取已知含量的样品 0.5 g共9份，精密称定，分别加入不同量浓度的对照品储备液，按供试品方法处理；在250 nm波长下进行含量测定，测得平均加样回收率为 100.16%，RSD为 1.87%，表明该方法准确可靠。结果见表 4。

表4 加样回收率试验结果

2.5.7 重复性 取同一供试品共 6 份，精密称定，按供试品的处理方法处理，并在 250 nm 波长下进行测定，测得样品平均质量浓度为 0.120%，RSD 1.50%(n=6)。结果表明，该方法重复性好，测定方法可行。

2.5.8 样品测定 取收集到的 25 批菠菜子药材，精密称定，按照“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件测定供试品中β-蜕皮甾酮的 含量，结果见表5。

表5 菠菜子中β-蜕皮甾酮的含量 (n=2)

根据25批样品的测试结果，暂定本品按干燥品计算，含 β-蜕皮甾酮(C27H44O7)，不得少于0.07%。

3 讨论

3.1 TLC鉴别 笔者同时对该方法进行系统耐用性实验，比较不同厂家(青岛海洋化工有限公司、烟台市化学工业研究所及上海盛亚化工有限公)的 3 种硅胶 G 薄层板进行比较，在不同湿度(25%、30%、40%)、不同温度(18 ℃、25 ℃、30 ℃)时对实验结果的影响。结果显示，供试品和对照品斑点均清晰，没有本质区别，说明该方法通用性较好。

3.2 浸出物考察 笔者采用不同浓度的(20%、40%、60%、80%、95%)乙醇溶液，分别用冷浸法和热浸法对菠菜子的浸出物得率进行考察，结果冷浸法得率较热浸法高，且冷浸法中 20%～60% 乙醇提取时，浸出物得率差异不明显。因此，选用稀乙醇为提取溶剂，采用冷浸法测菠菜子中浸出物。

3.3 供试品溶液的考察 分别对不同提取溶剂(70%、80%、90%、100%)甲醇和(70%、80%、90%、100% )乙醇、不同提取时间(20 min、3 min、40 min)、不同提取方式(超声提取、回流提取)、不同物料比(1∶25、1∶30、1∶40)进行考察，结果表明：在80% 甲醇为提取溶剂，超声提取30 min，物料比为1∶25时，供试品中 β-蜕皮甾酮的含量最高。

3.4 HPLC测定结果 菠菜子中 β-蜕皮甾酮含量范围在 0.073%～0.205%，其中产地为山东临沂、甘肃陇西、安徽亳州、河北安国及河南南阳的5批菠菜子中β-蜕皮甾酮含量显著高于产地为新疆和田的菠菜子。说明菠菜子中 β-蜕皮甾酮的含量高低可能与菠菜子的种植地有关，受种植环境的影响，β-蜕皮甾酮的含量会有所差异；也可能是由于这5批菠菜子采收时间较近，存放时间较短，造成含量有所差异。这为菠菜子的种植环境和存储的要求提供了参考，具体含量差异原因，后期会进一步深入研究。

4 小结

目前，国内对菠菜的研究仅限于种植方法、原植物组织形态和药理作用等方面，对菠菜及其果实中化学成分及其含量分析尚未见报道。笔者参照《中国药典》2015年版一部牛膝药材项的TLC鉴别和含量测定方法，建立菠菜子中β-蜕皮甾酮的TLC 鉴别和含量测定的方法，该方法简便、可靠、重现性好，并根据25批样品的测定结果，暂定本品按干燥品计，含β-蜕皮甾酮，不得少于0.07%，用于控制菠菜子药材的质量。本实验研究旨在为菠菜子安全用药和化学成分研究提供理论依据，为菠菜子药材标准提高奠定基础，也为更好的控制维药的质量和标准的提高提供参考。