尼可地尔对抑郁模型大鼠心肌KATP通道的影响

徐启明，刘军华，苏红英，曾海龙，刘凯东

抑郁症是情感障碍类精神疾病之一，以心境低落、食欲减退为主要临床表现。随着时代发展，普通人群患抑郁症比例逐年增加，因此，抑郁症对人类健康及生命安全造成极大威胁，而应激是除遗传因素之外诱发抑郁发生的重要机制之一。流行病学资料显示，长期高强度心理、生理应激反应导致抑郁症发生、发展及恶化，同时抑郁症与心血管疾病发生密切相关，抑郁症加重心血管系统疾病的发生、发展[1]。本研究观察抑郁模型大鼠心肌损伤情况及KATP通道抑制剂尼可地尔对抑郁模型大鼠心肌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器 兔抗大鼠Kir6.2抗体(sc-20809)，兔抗大鼠SUR2抗体(sc-25684)，兔抗大鼠β-actin抗体(sc-130657)均购自Santa Cruz Corporation(USA)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自博士德生物(BA1054)，Tris-HCL缓冲液(pH8.8)及Tris-HCL缓冲液(pH6.8)、SDS-PAGE电泳缓冲液及转膜缓冲液均购自北京碧云天，Nagar-Olsen染色试剂盒购自Sigma，5-羟色胺酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒购自北京碧云天，BL-420F生物机能实验系统，i Bright高清显色系统。

1.2 实验动物 取7周龄的清洁级雄性大鼠，体重180～190 g，在23.5～24.0 ℃干燥、通风条件饲养大鼠1周后，随机分为3组：对照组、慢性温和不可预知应激(CMS)组和尼可地尔组(0.1 mg/kg)，各12只，每组大鼠分别饲养2周、4周、6周及8周。每周记录1次大鼠体重及旷野实验评分、糖水喜好实验。

1.3 CMS诱导大鼠抑郁模型 根据参考文献[2]将鼠笼倾斜45°放置，同时将尾部悬吊5 min，剥夺大鼠饮食及饮水，更换大鼠光照方式使其昼夜颠倒。应激实验期每隔1周检测大鼠体重变化，实验结束后使用5-羟色胺试剂盒检测脑组织5-羟色胺含量。

1.4 尼可地尔处理大鼠 将鼠笼倾斜45°放置同时将尾部悬吊5 min，剥夺大鼠饮食及饮水，更换大鼠光照方式使其昼夜颠倒。应激开始第2周使用尼可地尔0.1 mg/kg灌胃大鼠持续至应激结束，实验期间每隔1周检测大鼠体重变化，持续至8周实验结束后使用5-羟色胺试剂盒检测脑组织5-羟色胺含量。

1.5 ELISA测定CMS组大鼠下丘脑及海马体5-羟色胺含量 将大鼠断头处死后置于冰盒上取出完整海马体及下丘脑组织，置于-80 ℃保存，使用电子匀浆器充分搅拌后于4 ℃离心机以7 000 r/min离心15 min。取上清液采用ELISA分析。

1.6 大鼠心肌损伤心率与心率变异性测定 采用1%戊巴比妥钠(45 mg/kg)对各组大鼠进行腹腔注射麻醉，将大鼠四肢以线绳固定于木板上并取仰卧位，采用动物多导生理记录仪及系统软件记录大鼠心率及心率变异性。

1.7 蛋白免疫印迹法检测大鼠损伤心肌KATP通道蛋白Kir6.2和SUR2表达水平

1.7.1 大鼠心肌蛋白样品制备 取大鼠心肌组织，使用磷酸盐缓冲液冲洗3次后应用电子匀浆搅拌器充分匀浆，再加入RIPA强裂解液超声破碎7次至混合液不再黏稠为止，4 ℃条件下，以7 000 r/min离心10 min，取上层清液加入SDS-上样缓冲液，之后沸水浴煮5 min，瞬时离心后-80 ℃保存。

1.7.2 BCA蛋白质定量分析 按照说明书方法制作蛋白标准曲线，在96孔板中分别加入200 μL的BCA蛋白定量A液、B液混合液(50∶1)，每孔加入18 μL蒸馏水及2 μL蛋白样品， 37 ℃条件下恒温孵育30 min后，使用酶标仪在A562 nm处检测蛋白浓度。

1.7.3 SDS-PAGE凝胶电泳 上样：每孔道上样蛋白质量50 μg；电泳、转模、封闭、抗体杂交：配制12%的分离胶、5%的浓缩胶及SDS-PAGE电泳缓冲液(pH7.5)，4 ℃条件下110 V恒压电泳，采用三层夹膜湿转方法将蛋白质从凝胶转移到NC膜上。4 ℃条件下以300 mA转膜1 h，将膜取出后使用含有5%脱脂奶粉的TBS-T溶液作为封闭液，室温摇浴封闭2 h后在4 ℃条件下层析柜摇浴孵育一抗过夜后将条带取出，使用TBS-T(2%Tween-20)室温洗膜3次，每次5 min；室温孵育二抗1 h，使用TBS-T(2%Tween-20)室温洗膜3次，每次5 min。ECL显色：将ECL A液与B液混合后滤膜滴加混合液，反应后于不同时间曝光后显色。

2 结 果

2.1 大鼠脑组织5-羟色胺表达水平 与对照组比较，CMS组8周时大鼠下丘脑及海马体组织5-羟色胺水平下降(P<0.05)；与CMS组比较，尼可地尔组大鼠下丘脑及海马体组织5-羟色胺水平升高(P<0.05)。详见图1。

与对照组比较，＊ P<0.05；与CMS组比较，#P<0.05。图1 各组大鼠下丘脑及海马体5-羟色胺含量比较

2.2 各组大鼠心率与心率变异性变化 饲养2周、4周、6周和8周，与对照组比较，CMS 组大鼠各时间心率降低(P<0.05)，心率变异性升高(P<0.01)；与CMS组各时间比较，尼可地尔组大鼠心率降低(P<0.05)，心率变异性升高(P<0.01)。详见表1。

表1 对照组、CMS组及尼可地尔组大鼠心率与心率变异性变化(±s)

2.3 各组大鼠心肌Kir6.2和SUR2表达水平比较 与对照组比较，CMS组2周、4周、6周、8周大鼠心肌细胞KATP通道(Kir6.2和SUR2亚基)蛋白表达水平升高(P<0.01)；与CMS组2周、4周、6周、8周比较，尼可地尔组大鼠心肌细胞KATP通道(Kir6.2和SUR2亚基)蛋白表达水平下降(P<0.01)。详见图2。

与对照组比较，＊P<0.01；与CMS组比较，#P<0.01。图2 各组大鼠不同时间心肌KATP通道受体蛋白Kir6.2和SUR2比较 (A为心肌细胞KATP通道蛋白表达电泳图；B为Kir6.2；C为SUR2)

3 讨 论

抑郁症是严重危害人类身心健康的一类精神疾病。相关研究证实，抑郁症导致心脏疾病可能是由于机体炎症反应促使巨噬细胞极化，促进粥样斑块形成及动脉粥样硬化恶化，同时促进血小板聚集，最终导致内皮功能及自主神经功能障碍[2-4]。抑郁症发生时，人体大脑产生的5-羟色胺及γ-氨基丁酸分泌下降，导致下丘脑-垂体-肾上腺轴功能降低，各类器官功能紊乱。现代医学认为心肌KATP通道作为一种细胞内代谢信号感受器主要由SUR2A和Kir6.2亚基组成，心肌KATP通道开放可有效减少动作电位时程从而降低心室率和钙离子内流，同时抑制线粒体内氧化自由基及活性氧产生，通过降低细胞凋亡与坏死水平从而增强机体对外界刺激适应性及耐受[5-8]。KATP通道开放引起心肌线粒体信号感受器过度开发，诱发线粒体外膜渗透压增高及线粒体结构和功能损伤，最终导致线粒体能量产生和代谢障碍。SUR2A亚基主要表达于心肌表面，负责mRNA运转，修复受损DNA，当机体出现应激、广泛损伤、缺血缺氧时SUR2A亚基上调可提高心肌细胞携氧能力以保护心脏免于损伤[9-10]。Kir6.2亚基是细胞膜KATP通道的一部分，Kir6.2结合ATP诱导KATP通道关闭，结合PIP2促进KATP开放，Kir6.2亚基与心脑血管疾病、糖尿病、癫痫等具有一定程度的相关性[11-12]

尼可地尔是一种KATP通道钾离子开放剂，临床广泛用于治疗急性冠脉综合征，本研究证实尼可地尔对抑郁大鼠产生的心肌损伤具有保护作用。本研究发现在CMS致抑郁大鼠下丘脑及海马体5-羟色胺明显减少，与人类发生抑郁症时机体5-羟色胺减少类似，因此证实缓慢应激对大鼠抑郁模型建立成功，给予缓慢应激及尼可地尔(0.1 mg/kg)的大鼠下丘脑及海马体5-羟色胺升高，具体机制将通过进一步研究证实。本研究结果还发现，CMS致抑郁时心率和心率变异性升高，证实缓慢应激引起心脏损伤，同时发现CMS组心肌KATP通道的Kir6.2亚基和SUR2亚基蛋白表达水平升高，因此推测，由于抑郁形成时心肌KATP通道发生改变，同时给予缓慢应激及尼可地尔(0.1 mg/kg)大鼠心率降低、心率变异率性改善，心肌KATP通道Kir6.2亚基和SUR2亚基蛋白表达水平下调，进而推测尼可地尔可能通过调控大鼠心肌细胞表面通道SUR2和Kir6.2亚基，诱导KATP通道开放进而降低心脏正常活动所需的能量，最终调控心肌细胞对损伤的耐受。尼可地尔通过抑制KATP通道开放，下调Kir6.2和SUR2蛋白的表达，从而减缓抑郁大鼠发生的心肌损伤。