青刺果内生真菌PUR-01的分离?鉴定及抗性评价

郑鹏 张玥 寇灿

摘要 从青刺果植株中首次分离得到菌株PUR-01，并对其进行分离纯化、抗性评价、形态学分析及分子生物学鉴定，探讨该菌株对2种热带作物病原真菌的抑菌活性研究。结果表明，青刺果内生真菌PUR-01对橡胶树胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和香蕉尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，Foc）均有一定的抑制作用，抑菌率分别为34%和24%，为进一步开展该菌株生防作用机理及应用研究提供基础。通过形态学及分子生物学鉴定，该菌为链格孢属（Alternaria alternata）真菌。

关键词 青刺果;内生真菌;分离;鉴定;抗性评价;橡胶树胶孢炭疽病菌;香蕉尖孢镰刀菌古巴专化型

中图分类号 Q93文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）08-0005-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.002

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Isolation，Identification and Resistance Evaluation of Endophytic Fungi PUR-01 from Prinsepia utilis Royle

ZHENG Peng，ZHANG Yue，KOU Can （Lijiang Teachers College，Lijiang，Yunnan 674100）

Abstract The strain PUR-01 was isolated for the first time from the Prinsepia utilis Royle plant，and it was isolated and purified，resistance evaluation，morphological analysis and molecular biological identification were carried out to explore the antibacterial activity of this strain against two tropical crop pathogenic fungi.The result showed that the endophytic fungi PUR-01 had certain inhibitory effects on Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，the inhibition rates were 34% and 24%，respectively.It provided the basis for research on biocontrol mechanism and application of endophytic fungi.By morphological and molecular biological identification，the strain was caused by Alternaria alternata.

Key words Prinsepia utilis Royle; Endophytic fungi;Isolation;Identification;Resistance evaluation;Colletotrichum gloeosporioides;Fusarium oxysporum f.sp.Cubense

青刺果（Prinsepia utilis Royle）为蔷薇科扁核木属（Prinsepia Royle）多年生落叶灌木[1]。青刺果果仁可以榨油，青刺果油中不饱和脂肪酸的含量较高[2]，符合人体代谢的生理需求，是一种绿色健康的食用油;另外，青刺果油与皮肤之间有良好的亲和性，因此，青刺果油是一种重要的天然护肤油脂[3]。

植物内生真菌（endophytic fungi）是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物出现明显感染病害的真菌[4]。一些植物体内的内生真菌一方面可以提供植物所需要的营养物质，另一方面可以提高宿主植物的抗病性、应对逆境环境，并可以产生与宿主植物相同或相似的活性物質[5-7]。截至目前，国内外对青刺果内生真菌的相关研究尚属空白，该研究从青刺果茎段及叶片中分离出对2种热带作物重要植物病原真菌具有一定抑菌活性及耐盐特性的内生真菌PUR-01。因青刺果全株均可入药，并具有活性、祛瘀、接骨消肿等功效，青刺果油还对防止高血压、治疗糖尿病、防止心血管疾病都有较好的效果[3]，因此，研究青刺果内生真菌具有十分重要的意义。该研究旨在为今后进一步开发利用青刺果内生菌资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：橡胶树胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，Foc），均由丽江师范高等专科学校提供。培养基：马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）用于内生真菌的分离、马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）用于内生真菌液体发酵。

1.2 方法

1.2.1 青刺果内生真菌的分离和纯化。选取新鲜健康青刺果叶片和茎段，将青刺果叶、茎段用流水冲洗1 h，晾干放入干净的烧杯中，用75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3次，再用0.5%新洁尔灭溶液浸泡20 min，无菌水冲洗3次，最后一次冲洗的无菌水留下备用。用无菌滤纸将青刺果叶片和茎段水分吸干后，加10 mL无菌水进行研磨，取1 mL左右的研磨液涂布在PDA平板上，静止2 min，随后倒置放于28 ℃培养。待观察到平板上菌落长出，采用平板划线法进行分离和纯化。直至得到纯菌株并将其接种到斜面PDA培养基上，液体石蜡密封并于4 ℃进行保存。

消毒可靠性设置：①将最后一次冲洗材料的无菌水1 mL涂布到PDA平板上，静止2 min，倒置放于相同条件下进行培养，观察结果。②参照组织印迹法[8]，将灭菌好的青刺果叶片、茎段各1片压入PDA平板内，使灭菌材料与PDA培养基密切接触30 min后，移去叶片和茎段。倒置于28 ℃培养。

1.2.2 青刺果内生真菌PUR-01抑菌活性初筛及复筛。

1.2.2.1 内生真菌抑菌活性初筛。将内生真菌PUR-01、供试菌株活化后，用打孔器分别打出菌饼（0.9 cm×0.9 cm），在无菌条件下，将内生真菌PUR-01菌饼接种于培养皿中央，供试菌株橡胶树胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，Foc）分别接种于青刺果内生真菌PUR-01两侧，间隔2～3 cm，每个培养皿接种相同的供试菌株2块，置于28℃培养7 d。每个处理重复3次。

1.2.2.2 内生真菌抑菌活性复筛。在无菌条件下用接种针挑取青刺果内生真菌 PUR-01 少量菌丝接种于100mL发酵液（PDB培养基）中进行发酵，发酵条件设置：摇床转速180 r/min，发酵培养的温度为恒温25 ℃，时间为6 d。

待PDA培养基温度降低至50～60 ℃时，将上述1mL发酵滤液与9mL融化的 PDA 培养基混匀，倒入无菌培养皿内，制成平板。待培养基凝固后，在每个培养基平板上接入1个供试菌株菌饼（直径为9 mm），使带菌丝的一面贴在培养基表面，将平板置于25℃培养72 h。以无菌水为对照，每处理 3 次重复，采用十字交叉法测量菌落生长直径，计算抑制率[9]：菌丝生长抑制率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径]×100%。

1.2.3 青刺果内生真菌PUR-01形态学鉴定。参照载玻片培养观察法[10]。

1.2.4 青刺果内生真菌PUR-01分子生物学鉴定及系统进化树构建方法。

挑取青刺果内生真菌 PUR-01 少量菌落接种于20 mL PDB培养基中，25 ℃、180 r/min 摇床培养5 d。真菌DNA根据真菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法提取，真菌ITS序列PCR扩增使用通用引物 ITS1和ITS4（ITS1：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′; ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。根据测序结果，在美国国立生物技术信息中心NCBI GenBank数据库中进行BLAST分析，用ClustalX软件进行多序列比对（multiple alignments），并用Mega软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 青刺果内生真菌PUR-01分离纯化

通过可靠性检验，未发现有菌落长出。说明该试验对青刺果外植体的消毒是彻底的。通过培养，从含有研磨液的PDA平板上用平板划线法不断分离、纯化，最终获得青刺果内生真菌PUR-01。

2.2 青刺果内生真菌PUR-01抑菌活性初筛及复筛

以平板对峙法初步检测青刺果内生真菌PUR-01对供试2种热带作物病原真菌菌株的抑菌活性，从图1可以看出，青刺果内生真菌PUR-01对供试的香蕉尖孢镰刀菌古巴专化型抑菌活性较为明显，而对橡胶树胶孢炭疽病菌抑菌活性不明显;结果表明，青刺果内生真菌PUR-01对供试的香蕉尖孢镰刀菌古巴专化型具有明显的拮抗性。为进一步评价青刺果内生真菌PUR-01的抑菌活性，采用菌丝生长速率法[9]进行复筛，从表1可以看出，青刺果内生真菌PUR-01对橡胶树胶孢炭疽病菌和香蕉尖孢镰刀菌古巴专化型的抑制率分别为34%、24%，由此可知，青刺果内生真菌PUR-01对2种热带作物病原真菌都具有一定的抑菌活性，但抑菌活性均比较低。

2.3 青刺果内生真菌PUR-01形态学鉴定

从图2可以看出，青刺果内生真菌PUR-01菌落表面为绒状，圆形，黑色至灰色，同心轮纹。菌落背面黑色至灰色。基内菌丝发达，有隔，菌丝单生或分枝。分生孢子链生，卵形或长椭圆形，黄褐色，分子孢子横隔膜3～6个，纵或斜隔膜0～2个，短喙柱状。参照《真菌鉴定手册》[11]，将青刺果内生真菌PUR-01初步鉴定为链格孢属（Alternaria alternata）真菌。

2.4 青刺果内生真菌PUR-01分子生物学鉴定及系统发育分析 通过18S rDNA的ITS序列进行PCR扩增，回收产物纯化后送上海生物工程公司测序。将测序结果导入到NCBI进行Blast比对，采用MEGA 6.06软件用Neighbour-joining法构建系统发育树，参数设置如下：Bootstrap method重复抽样次数为1 000;Gaps/Missing Data Treatment 采用Pairwise deletion模型，得到图3。从图3可以看出，该菌的ITS序列和Alternaria alternata strain（基因登录号KR912224.1）、Alternaria alternata strain（基因登录号KX783397.1）聚为一簇，结合该菌的形态特征，认为该菌为半知菌纲、链孢霉目、黑霉科、链格孢属（Alternaria alternata）。

3 讨论与结论

青刺果作为一种特殊的油料植物越来越受到丽江市人民政府的重视，青刺果因其全株可以入药一直被纳西族所利用，其嫩尖还可以泡茶或做凉拌菜。研究表明，青刺果多糖对糖尿病小鼠肝脏具有保护作用[12];青刺果种粕粉乙酸乙酯提取物通过柱层析后抑菌活性大大提高[13]，青刺果油还具有调节血脂、抑制血小板聚集、抗氧化、护肤等作用[14-18]。目前，研究药用植物内生真菌并从中发现具有活性成分和结构新颖的化合物已成为研究热点[19-21]。青刺果作为一种兼药用和食用的特殊植株，对其内生真菌的分离及應用存在空白。该试验通过对青刺果内生真菌的分离，并用2种重要热带作物病害为病原指示菌，发现分离的内生真菌PUR-01对2种供试菌具有一定的抑菌活性但抑菌活性都不强;通过形态学及分子生物学鉴定，该菌为链格孢属（Alternaria alternata）真菌，这也是首次从青刺果茎叶中分离到的真菌。链格孢属（Alternaria alternata）真菌是一种常见的可引起作物病害的病原菌，在全球分布最广，95%以上的种类都兼性寄生在植物上，为潜在的病原菌[22-24]。此外，链格孢属真菌也是一类具有开发潜力的生物资源，其代谢产物具有杀虫、杀菌的作用，能够提高植物自身免疫力，对多种植物病害有较高的防效[25]。

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