棉铃虫APN基因家族系统进化与功能分析

牛琳琳，ZAW Lin Naing，张彩虹，EI Thinzar Soe，梁革梅

（中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

APNs（氨肽酶家族）属于肽链端解酶，可使氨基酸从多肽链的N末端顺序逐个地游离出来[1]，参与生物体内蛋白翻译水平调控、肽激素水平调控、应激反应以及与健康和疾病相关的细胞反应等过程[2]。在昆虫中，存在于消化道和肠腔中的APN，主要功能是与肽链内切酶和羧肽酶共同起作用，分解来自食物的蛋白[3]。研究者根据APNs的基因序列系统进化分析结果将鳞翅目昆虫APNs分为8类，分别命名为APN1到APN8，每类分支中通常有多于一种的APN，同一物种的不同分支间氨基酸同源性为23%～40%，同一分支不同物种间的同源性为50%～95%[4,5]。目前，有143条APN的cDNA已经从27种鳞翅目昆虫中被克隆、分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

昆虫中肠上的受体蛋白与Bt结合是Bt发挥杀虫作用的关键，而且受体蛋白的变异与昆虫对Bt的抗性密切相关。氨肽酶N是最早被鉴定出来的Bt受体蛋白[6]，烟草天蛾Manduca sexta的APN通过分离纯化后可与Bt蛋白进行体外结合，是最早被确定的Cry1Ac受体[7]。2002年Gill等[8]采用显微注射法获得了含烟草天蛾APN基因的黑腹果蝇Drosophila melanogaster，APN在非敏感宿主果蝇中肠和中胚层获得了表达，这种转基因果蝇对Cry1Ac毒素变得很敏感，该研究首次从虫体水平证实APN是Cry1Ac的功能性受体。Lin等[9]在Sf9昆虫细胞中成功表达家蚕APN6，细胞生测结果显示BmAPN6参与Cry1Ac诱导的细胞形态异常和裂解死亡过程。以往的研究结果表明，不同APN所结合的Cry蛋白种类不尽相同，而且昆虫对Bt产生抗性后 APN基因的表达量变化也有差异，有的在抗性昆虫中显著降低，有的却显著升高。Pigott和Ellar[10]认为，APN在对Bt敏感性不同昆虫中的表达量不同可能与APNs在不同种类昆虫中作为Bt受体的相对重要性不同相关。因此，昆虫APNs可能在不同Bt的杀虫机制及抗性机制中发挥着不同的作用。

自1997年Bt棉花在我国种植以来，棉铃虫的为害得到了有效控制，但随着种植年限的延长，棉铃虫对Cry1Ac的敏感性逐渐降低，抗性风险不容忽视[11]。Angelucci等[12]通过分析棉铃虫中肠的cDNA文库发现了7种APN，其中有4种可以和Cry1Ac结合；我们实验室也对棉铃虫APN进行了一系列研究，包括基因克隆、分离纯化，并证实 HaAPN1是 Cry1Ac的受体、在幼虫不同龄期中的表达量不同等[13-16]。对HaAPNs参与杀虫机制、抗性机制中的功能也进行了探讨，如HaAPN4可以与Cry1Ac、Cry2Aa都结合，沉默 APN4基因使棉铃虫对 Cry2Aa的敏感性降低；通过抗体封闭试验证实 HaAPN1和 HaAPN4参与Cry1Ac、Cry2Aa棉铃虫的杀虫过程[17-19]；HaAPN1片段缺失导致棉铃虫对Cry1Ac的抗性[20]；HaAPN1的表达量在不同水平的Cry1Ac抗性品系棉铃虫中都显著降低，而HaAPN5在不同抗性品系中表现不同，有的升高有的降低[21]。但总体来说，对棉铃虫APN家族所有的基因缺乏系统的比较、分析，因此，无法全面评价不同APNs的作用。本研究我们克隆得到7个棉铃虫APN基因全长序列后，对HaAPNs进行了系统进化分析，并比较了HaAPN1−7基因在Cry1Ac敏感和抗性棉铃虫中的表达量，还分析了棉铃虫取食不同种类的Bt蛋白后APN活性的变化，以期系统地分析这7种APNs的功能，为进一步明确棉铃虫APNs在Bt杀虫、抗性机制中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

96S敏感品系棉铃虫1996年采集自河南省新乡县棉田，在实验室用人工饲料饲养至今，在此期间未接触过任何杀虫剂[22]。BtR品系是由96S敏感品系棉铃虫持续饲喂Cry1Ac蛋白筛选得到的，对Cry1Ac的抗性倍数超过1800倍。96S-Cry2Ab品系是由 96S敏感品系棉铃虫持续饲喂 Cry2Ab蛋白筛选得到的，对Cry2Ab的抗性倍数为28倍。96S-Vip3Aa品系是由96S敏感品系棉铃虫持续饲喂Vip3Aa蛋白筛选得到的，对Vip3Aa已具有一定耐受性。

各品系棉铃虫均在温度（26±1）℃，光周期16L:8D，相对湿度（75±10）%的条件下饲养。

1.2 供试蛋白

Cry1Ac、Cry2Ab、Vip3Aa蛋白购自北京美延农业科技有限责任公司。

1.3 棉铃虫中肠总RNA提取和cDNA第一链的合成

取棉铃虫5龄初幼虫30头，于冰上解剖截取中肠，在0.7% NaCl溶液中清洗掉中肠内含物，用滤纸吸干中肠的水分，液氮速冻后在-80 ℃冰箱内保存备用。棉铃虫中肠总RNA采用Trizol法进行提取[23]，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性并用NanoDrop1000紫外分光光度计检测其浓度和纯度。

按照FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（天根公司）说明书，取2 μg总RNA进行反转录。

1.4 棉铃虫APNs全长基因克隆

分析GenBank上传的棉铃虫APNs序列信息，对无APN全长的基因（APN4～7）先设计中间引物，然后进行3′ RACE PCR。按照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（Takara公司）说明书以QT（表1）引物反转录得到的3′ cDNA为模板进行PCR。

表1 反转录和PCR所用引物Table 1 Primers used for reverse transcription and PCR

设计特异性引物以棉铃虫中肠cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL：cDNA模板2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，5×TransStart®FastPfu Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4μL，TransStart® FastPfu DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 31 μL。PCR 反应程序为：预变性 95 ℃ 1 min，1个循环；变性95 ℃ 20 s，退火55 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 2 kb/min，40个循环；终延伸72 ℃ 5 min，1个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化后连接到pEASY-Blunt Simple克隆载体上，转化至Trans1-T1感受态细胞，37 ℃培养箱培养后挑选阳性单克隆菌斑送至中美泰和有限公司进行测序。测序结果用NCBI-Blast进行同源序列检索比对后用DNAMAN进行拼接得到全长序列。

1.5 棉铃虫APNs基因序列分析和系统进化树构建

利用ExPaSy-PROSITE（http://web.expasy.org/compute_pi）预测APNs蛋白的分子量和等电点；利用NetNGLyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGLyc/）预测APNs蛋白的N-糖基化位点；利用NetOGLyc 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNOLyc/）预测APNs蛋白的O-糖基化位点；利用GPI-SOM（http://gpi.unibe.ch/）预测APNs蛋白的GPI（Glycosyl-phosphatidylinositol）锚定位点；在NCBI上搜索鳞翅目其他昆虫的APN氨基酸序列，利用Mega 7软件采用邻接法构建已知鳞翅目昆虫的APN系统发育进化树。

1.6 不同抗性品系棉铃虫APNs表达量差异分析

取各品系5龄初棉铃虫幼虫90头，30头为一个生物学重复，共3次重复。棉铃虫中肠提取、中肠总RNA提取及cDNA第一链的合成同1.3。

根据扩增得到的棉铃虫APN1～7基因全长序列设计实时荧光定量PCR引物（表2），内参引物选用核糖体蛋白S15基因（RPS15）。所有引物均进行荧光定量PCR验证扩增效率。荧光定量PCR采用SYBR Green染料法。不同抗性品系APNs表达量差异分析利用本步骤中合成的cDNA，PCR反应体系为20 μL，组分为 2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正向和反向引物各 0.6 μL，cDNA 模板 1 μL，50×ROX Reference Dye△0.4 μL，ddH2O 7.4 μL，PCR 程序按照 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根公司）试剂盒说明书进行。

表2 荧光定量PCR所用引物Table 2 Primers used in qPCR

APNs表达量差异以内参基因（RPS15）表达量为标准参照，用2-△△Ct相对定量法计算APNs的表达量差异[24]。用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行处理分析，采用Tukey检验进行处理间差异显著性分析。

1.7 中肠酶液和BBMV中的APN活性的测定

将配制好的棉铃虫人工饲料切成边长约为0.5 cm的正方体小块，加到24孔昆虫饲养板中。用25 mmol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲液（pH 10.5）将Bt蛋白稀释成需要浓度，按照0～6.25 μg/larva剂量添加Bt蛋白到饲料表面，待Bt蛋白完全渗入饲料后，将预先饥饿4 h后的5龄初棉铃虫幼虫接到饲料上。每处理接虫24头，重复3次。待棉铃虫将各处理饲料取食殆尽（8 h），收集幼虫。

于冰上解剖各处理棉铃虫，将中肠及内含物取出置于2 mL离心管中，加入预冷的1 mL 150 mmol/L NaCl，微量组织研磨器研磨约10 s，4 ℃、12000 r/min离心15 min，吸取上清液于新的离心管中，再重复离心一次，上清液即为中肠酶液。棉铃虫中肠BBMV提取参照Wolfersberger等[25]的方法进行。利用Bradford法测定中肠酶液和BBMV中总蛋白浓度。

参照Watanabe等[26]和Takesue等[27]的方法，以1 mg/L LpNA的甲醇储备液作为反应底物，在96孔酶标板中每孔加入5 μL样品和195 μL底物溶液，37 ℃反应60 min后，405 nm波长下测量吸光值。

APN活性计算方法：U＝（△A/△t）×（V总反应体积/v样品体积）×（1000/ɛ）μmol/min（消光系数ɛ＝9.9/mmol/cm）；APN 特异活性＝U/mg protein＝（△A×264.0787）/蛋白浓度，APN 活力单位为μmol/min/mg protein。

数据分析同1.6。

2 结果与分析

2.1 棉铃虫APNs基因序列分析

通过 PCR克隆得到的 7条棉铃虫APN基因全长序列HaAPN 1～7，已上传至 GenBank，登录号为MT002819～MT002825。经 ExPaSy-PROSITE、GPI-SOM 等生物信息学网站分析，HaAPN 1～7全长为2592～3099 bp，编码863～1032个氨基酸，分子量为110～115 kDa，等电点为4.7～6.4，N端信号肽为15～20 aa。除HaAPN7以外，HaAPN1～6都有GAMENWG和HEX2HX18E基序；HaAPN1、HaAPN2，HaAPN3的C末端都有一段多聚苏氨酸序列；HaAPN1～7蛋白C末端都有一个GPI锚定位点；HaAPN1、HaAPN2，HaAPN3的O-糖基化位点有16～39个；除了HaAPN2无N-糖基化位点，其余HaAPNs均有1～8个N-糖基化位点。具体序列信息分析见表3。

表3 棉铃虫APN1～7生物信息学分析Table 3 Bioinformatics analysis of HaAPN1—7

2.2 棉铃虫APNs系统发育分析

从NCBI下载了22种鳞翅目昆虫APN氨基酸序列共86条（包括本研究所克隆的7条HaAPNs序列），利用Clustal W进行多序列比对，采用Neighbor-Joining构建鳞翅目APN系统发育进化树（bootstrap＝1000），结果显示鳞翅目在进化上分为9个分支，其中棉铃虫APN1～7基因分别在其中的7个分支Class 1～7上。Class 1中包括16个物种；Class 2中包括11个物种；Class 3共有17个物种，Class 3在进化关系上与Class 1的亲缘关系最近，但与Class 1相比O-糖基化位点更少；Class 4与Class 2一样C末端无苏氨酸富集区，此类别包含11个物种；Class 5中包含8个物种，Class 6中包含6个物种；Class 7～9中仅包含2～3个物种。从棉铃虫APN进化上的亲缘关系上来看，棉铃虫APN1与澳洲棉铃虫Helicoverpa punctigera、烟芽夜蛾Heliothis virescens、甜菜夜蛾Spodoptera exigua的APN1亲缘关系较近；棉铃虫APN2与甜菜夜蛾APN5、粉纹夜蛾Trichoplusia ni APN5亲缘关系较近；棉铃虫APN3与澳洲棉铃虫APN3亲缘关系最近；棉铃虫APN4与澳洲棉铃虫APN2亲缘关系最近；棉铃虫APN5与粉纹夜蛾APN2亲缘关系最近；棉铃虫APN6与甜菜夜蛾APN6亲缘关系最近；棉铃虫APN7与欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis APN7亲缘关系最近（图1）。

图1 鳞翅目昆虫APNs进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of Lepidoptera insects APNs

2.3 Cry1Ac敏感和抗性品系棉铃虫中HaAPN1～7表达量

在96S敏感棉铃虫中HaAPNs表达量差异显著（F6,21＝343，P＜0.0001），表达量由高到低依次为HaAPN2，HaAPN1，HaAPN4，HaAPN3，HaAPN5，HaAPN6，HaAPN7，其中HaAPN2的表达量比HaAPN1高约1倍且达到显著水平（P＝0.002）；HaAPN4的表达量显著低于HaAPN1（P＜0.0001），HaAPN3的表达量显著低于HaAPN4（P＝0.001）；HaAPN5与HaAPN3表达量差异不显著（P＝0.38）；HaAPN5～7表达量差异不显著（P＞0.57）（图2A）。

在 BtR抗性棉铃虫中 HaAPNs表达量差异显著（F6,21＝184，P＜0.0001），表达量由高到低依次为HaAPN2、HaAPN1、HaAPN4、HaAPN3、HaAPN5、HaAPN6和 HaAPN7，其中 HaAPN2的表达量比 HaAPN1高约2倍且达到显著水平（P＜0.0001）；HaAPN3～6表达量均显著低于HaAPN1（P＜0.0001）；HaAPN3～7表达量无显著差异（P＞0.07）（图2B）。

图2 Cry1Ac敏感（A）和抗性（B）品系棉铃虫中HaAPN1～7表达量Fig. 2 Expression level of HaAPN1—7 in Cry1Ac-susceptible (A) and -resistant (B) strain

2.4 敏感品系棉铃虫取食不同Bt蛋白后中肠APN活性的变化

取食Cry1Ac蛋白后，96S棉铃虫中肠APN活性变化明显（中肠酶液: F6,14＝7.33，P＝0.001；BBMV：F6,14＝457，P＜0.0001），与取食正常饲料的棉铃虫相比，2 ng/larva（P＝0.0009）、50 ng/larva（P＝0.018）和0.25 μg/larva（P＝0.003）剂量处理的棉铃虫中肠酶液中APN活性显著下降；所有不同Cry1Ac剂量处理的棉铃虫中肠BBMV中APN活性与对照相比显著下降（P＜0.0001）。取食Cry2Ab蛋白后（F6,14＝2.11,P＝0.117），中肠酶液中APN活性无显著变化（P＞0.18）；但与对照相比，所有剂量处理中肠BBMV中APN活性都显著降低（F5,12＝181，P＜0.0001；1.25 μg/larva：P＝0.029；其余剂量：P＜0.0001）。取食Vip3Aa蛋白后，与对照相比，各个处理中肠酶液中APN活性显著降低（F5,12＝144，P＜0.0001；所有剂量：P＜0.0001）；除了10 ng/larva剂量处理外，中肠BBMV中APN活性也都显著降低（F5,12＝117，P＜0.0001；10 ng/larva：P＝0.965；其余剂量：P＜0.0001）（图3）。

图3 取食不同Bt蛋白后敏感品系棉铃虫中肠APN活性Fig. 3 APN activity in the midgut of Helicoverpa armigera susceptible larvae after fed different Bt proteins

2.5 不同Bt抗性品系棉铃虫中肠APN活性的比较

与96S敏感品系棉铃虫相比，各Bt抗性品系棉铃虫中肠APN活性显著降低（中肠酶液：F3,8＝32.9，P＜0.0001；BBMV：F3,8＝21.3，P＝0.0004），其中BtR品系（P＝0.0004）和96S-Vip3Aa品系（P＝0.004）棉铃虫中肠酶液中APN活性显著降低，96S-Cry2Ab品系与96S无显著差异（P＝0.564）；而在BBMV中，与96S棉铃虫相比，96S-Vip3Aa品系（P＝0.0004）APN活性显著降低，96S-Cry2Ab品系（P＝0.056）和BtR品系与敏感品系差异不显著（P＝0.841）（图4）。

图4 不同Bt抗性品系棉铃虫中肠APN活性的差异Fig. 4 Differences of APN activity in the midgut of Helicoverpa armigera from different Bt resistant strains

3 讨论

鳞翅目昆虫中肠APNs的分子量从100到180 kDa不等，具有多个保守区域，从蛋白的N端到C端依次为信号肽、蛋白前体区、GAMENWG基序、HEX2HX18E锌指结构基序、苏氨酸富集区、糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl-phosphalidylinositol，GPI）锚定信号位点[28]。本研究克隆得到的HaAPN1～7都具有这些APN家族的共同特征。HaAPN1～7中，只有APN7没有保守的GAMENWG基序和HEX2HX18E锌指结构基序，证明APN7不是一个有活性的氨肽酶N基因[12]。棉铃虫APN4～7基因C末端没有苏氨酸富集区，此区域也是APN的O-糖基化位点；具有苏氨酸富集区的APN1～3含有的O-糖基化位点的个数也不相同，HaAPN1和HaAPN2分别有39和31个O-糖基化位点，HaAPN3有16个（表3）。相比于O-糖基化位点，每个棉铃虫的APN基因只有少数几个N-糖基化位点，其中HaAPN2无N-糖基化位点。APN的糖基化位点通常被认为可能是Cry1Ac的结合区域[10,12]，不同APN糖基化位点的差异可能是APNs与不同Bt蛋白结合存在差异的主要原因。例如，Cry1Ca蛋白与烟草天蛾106 kDa 的APN 结合、但不能和115 kDa大小的APN结合[29]；欧洲玉米螟中APN1结合Cry1Ab和Cry1Fa，APN3a、APN8只结合Cry1Fa，APN2、APN3b，与Cry1Ab和Cry1Fa都不结合[30]；棉铃虫APN1～4均可以和Cry1Ac结合[12]，其中APN1除了能与Cry1Ac结合外还能与Cry1Aa和Cry1Ab结合，APN2则只能与Cry1Ac结合[20,21,31]。因此，我们推测棉铃虫APN1～6与不同的Bt可能存在不同的结合谱。

Pigott and Ellar[10]进行系统发育分析后将鳞翅目序列划分为5个类群，随着基因组测序技术的发展，越来越多昆虫的APN同工酶序列被克隆出来，鳞翅目APNs又进一步被细致地分为8个类群[4]，在此基础上Hughes[5]基于鳞翅目APNs的保守衍生基序，去掉Class7分支后加上双翅目APNs，然后重新分析了鳞翅目APNs的系统发育情况[5]。本研究整合目前在NCBI上的鳞翅目APNs全长序列，除去无信号肽和GPI锚定位点的PSA（puromycin-sensitive amino）类APN[4]，进行系统发育分析将其分为9个类群，Class 1～9。目前，不同类群APN均有作为Bt受体的报道，其中Class1～4类群APNs与Cry蛋白的相互作用研究较为广泛，Class 1中烟草天蛾APN1[32]、小菜蛾PxAPN-A[33]、棉铃虫APN1[20,31]、粉纹夜蛾APN1[34]已报道为Cry1Ac的受体；Class 2中烟草天蛾APN2可以与Cry1Ab5结合[7]；Class 3中家蚕和小菜蛾APN3[35]、棉铃虫APN3[3]、烟芽夜蛾120 kDa APN[37]、舞毒蛾APN1[38]可作为Cry1A的结合蛋白也有相关报道；Class 4中家蚕和小菜蛾的APN4可以与Cry1Aa、Cry1Ab结合[35]。Class 5～9类群作为Cry蛋白的受体报道还很少。

为了明确APN在Bt杀虫或抗性机制中的作用，人们常用RNAi技术干扰APN的表达来明确其功能，如通过降低棉铃虫、美国白蛾、甜菜夜蛾、二点委夜蛾Athetis lepigone等的APN基因表达量，证实了APN是Cry类蛋白的受体[39-42]。APN突变或表达量的改变与棉铃虫[20]、甜菜夜蛾[43]、粉纹夜蛾[34]等对Cry1类蛋白的抗性相关。我们的研究结果显示棉铃虫中肠APN1～7的表达量存在显著差异，其中APN2的表达量最高，APN7的表达量最低；而且Cry1Ac抗性品系棉铃虫中各类APN的表达趋势与敏感品系一致。我们推测，HaAPN1～7可能在分解蛋白、作为结合受体等方面有不同的重要性。

Chougule等[44]曾报道，取食不同的饲料会造成棉铃虫APNs表达量的差异；Cry1Ab抗性品系小蔗螟APN蛋白酶活性和表达量较敏感品系都显著降低，敏感幼虫APN被RNAi后，APN活性降低、对Cry1Ab敏感性降低[45]。我们的研究结果显示敏感品系棉铃虫取食Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa蛋白后中肠APN活性显著降低，其中取食Cry1Ac和Vip3Aa蛋白后中肠酶液中APN活性显著降低，取食Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa蛋白后中肠BBMV上APN活性都显著降低（图3）。棉铃虫对Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa产生耐受性后，中肠酶液和 BBMV中APN活性也发生了显著变化，而且与96S棉铃虫相比，BtR品系和96S-Vip3Aa品系棉铃虫中肠酶液中APN活性显著降低，96S-Vip3Aa品系棉铃虫BBMV中APN活性显著降低（图4）。说明棉铃虫取食不同的Bt或对不同Bt有耐受性后，在中肠酶液中和BBMV上APN的活性变化不同。由此，我们推测棉铃虫APN活性的变化与Bt蛋白的降解及抗性演化相关，但具体的功能有待以后进一步验证。