抗菌肽及其在动物生产中的应用

刘梦雪，杨 瑞，刘优优，李蕴玉，李佩国

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛，066604)

抗菌肽(Antimicrobial Peptides, AMPs)通常由20～60个氨基酸残基组成[1]，具有多种生物学活性，是生物体固有免疫的重要组成部分[2]。天蚕素(cecropins)是通过向惜古比天蚕蛹的免疫血淋巴中注射阴沟肠杆菌和大肠杆菌后被诱导、分离和纯化出的第一个抗菌肽[3]，目前APD数据库(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)已收录了3 250种抗菌肽，并有新的抗菌肽被不断地产生与发现。抗菌肽具有广谱抗菌、不易引起细菌耐药、无免疫原性[4]和独有的破膜杀菌机制等优点，已作为抗生素替代品在畜牧业、农业、食品工业和医药卫生等领域显示出良好的发展前景。笔者从抗菌肽的分类、功能及其在动物生产中的作用效果进行综述，以期为抗菌肽作为抗生素替代品在动物养殖生产中的合理和深入应用提供参考。

1 抗菌肽的分类方式

抗菌肽种类繁多，可根据不同的研究系统以多种方式进行分类，目前主要是根据其生物来源和结构特征进行分类。

1.1 根据生物来源分类

1.1.1植物源性抗菌肽植物源性抗菌肽是植物内分泌系统分泌的能够抵御外界环境中微生物入侵的小分子多肽。根据序列相似性、半胱氨基酸序列和二硫键模式的不同，可被分为8类：硫素(thionins)、防御素(defensins)、橡胶蛋白类(hevein-like peptides)、打结素类(knottin-type peptides)、脂转移蛋白(lipid transfer proteins)、蜕皮素(snakins)、α-hairpinin家族和未分类的CRP抗菌肽[5,6]。

1.1.2昆虫源性抗菌肽昆虫源性抗菌肽一般是由昆虫的血淋巴和机体组织在昆虫被微生物感染或意外伤害时产生[7]，这种抗菌肽对多种细菌和真菌有抗菌作用，但对自身正常细胞无毒害作用。根据氨基酸序列和结构的不同可将其分为3类：天蚕素类抗菌肽、防御素类抗菌肽、富含脯氨酸或富含甘氨酸的抗菌肽[8]。

1.1.3动物源性抗菌肽动物源性抗菌肽根据其来源和分类的不同可分为哺乳动物类、禽类、两栖类、鱼类和其他类。根据分子的总电荷不同又可分为阴离子和阳离子2种抗菌肽，其中阳离子抗菌肽较多，在哺乳动物研究中较为深入，根据分子结构的不同可分为速激肽和防御素2种[9]。

1.1.4微生物基因工程抗菌肽由于天然性抗菌肽含量较少，不易提取，大量应用不仅困难且成本较高，而微生物丰富多样，具有易于繁殖和生长迅速等优点，因此，利用基因工程重组技术异源表达系统可以解决抗菌肽在体内分泌过少难以提取的问题。细菌和酵母表达系统是抗菌肽生产的主要表达系统，又因真核与原核的差异而存在着各自的特点[10]。此外，杆状病毒和转基因动植物表达系统也被经常使用[11]。

1.1.5人工合成抗菌肽随着抗菌肽研究的深入进行，人工合成方式如改造抗菌肽的氨基酸序列或对抗菌肽片段进行设计等可以快速大量获得所需的抗菌肽。且合成的目的抗菌肽在相应生物基质中同样具有优良的抗菌活性，甚至比亲本抗菌肽的生物活性更强[12]。

1.2 根据结构特征分类

抗菌肽的结构特性与其生物学特性密切相关，根据二级结构的不同，可将其分为以下4类：α-螺旋结构抗菌肽，这类抗菌肽具有两亲性，即亲水性和疏水性，分布广泛且多样；β-折叠结构抗菌肽，多来源于动物和植物，可通过2个或2个以上的二硫键来稳定结构；环链状结构抗菌肽，在C端结尾处有1个分子内二硫键来成环；伸展性结构抗菌肽，呈线性结构，富含有1种或几种氨基酸残基[13,14]。此外，还可根据所含氨基酸种类的不同将其分为不含半胱氨酸的线性阳离子α-螺旋肽、含半胱氨酸和1～3个二硫键的抗菌肽、含特别氨基酸的线肽[11]。

2 抗菌肽的功能

2.1 抗细菌功能

相比于传统抗生素，抗菌肽不易产生耐药性且具有抗菌谱更广的抗菌活性。张炜等[15]通过微量倍比稀释法和扩散法发现抗菌肽BSN-37对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌有较好的抗菌作用，其中大肠杆菌CVCC1568能在90 min内被完全杀死。Ageitos等[16]研究表明，一些含有2～4个氨基酸的短线性抗菌肽对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌具有很高的抑菌活性，并发现最小抑菌浓度为2×10-8～6×10-8mol/L。Li等[17]发现，从鲶鱼皮肤粘液中提取出的抗菌肽CF-14可以增加大肠杆菌细胞膜通透性，并表明CF-14可能通过作用于大肠杆菌细胞内靶点而穿透大肠杆菌细胞膜，从而对大肠杆菌起到抑菌作用。

2.2 抗真菌功能

近年来，由真菌感染和真菌耐药引起的发病率和死亡率逐渐上升，特别是由念珠菌和曲霉引起的侵袭性真菌感染最普遍[18]。研究发现，一些抗菌肽对部分真菌具有很好的抗性，如Yang等[19]报道，新型家蝇抗菌肽AMP-17可抑制或杀灭白色念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯念珠菌、近缘念珠菌和新生隐球菌，最低抑菌浓度为9.375～18.75 μg/mL，最低杀菌浓度为18.75～37.5 μg/mL。马慧玲[20]研究发现，抗菌肽AMP-17可以通过破坏白色念珠菌细胞壁、干扰细胞膜结构、改变细胞膜通透性、增加胞内渗透压以及影响白色念珠菌细胞壁细胞膜合成相关基因的表达来发挥抗真菌效果，同时，AMP-17还可以抑制白色念珠菌的细胞分裂过程，改变细胞周期进程。Khani等[21]研究发现，抗菌肽Skh-AMP1在浓度为4×10-5mol/L和8×10-5mol/L条件下对未发芽的烟曲霉孢子具有杀孢活性，表明Skh-AMP1的抗烟曲霉菌活性可能与其破坏真菌细胞膜通透性和诱导增强活性氧产生的能力有关。

2.3 抗病毒功能

抗菌肽可通过结合宿主细胞膜或病毒囊膜来中和病毒直接作用于病毒颗粒，还可间接干扰病毒生命周期的不同阶段来阻止病毒感染[22]。朱志翠等[23]研究发现，家蝇抗菌肽MAF-1A能直接破坏甲型流感病毒(IAV)形态结构的完整性，导致其不能正常复制增殖，还可以阻止IAV的吸附，干扰其释放，并提示MAF-1A是通过对多靶点作用而发挥抗流感病毒效应。张亚[24]研究表明，鸡β-防御素7(AvBD7)蛋白和鸡β-防御素10(AvBD10)蛋白对马立克氏病病毒(MDV)有较好的抑制作用，体内注射Av BD7或Av BD10能减轻MDV感染所造成的伤害。

2.4 抗寄生虫功能

对于引起人类及动物寄生虫病的寄生虫，如疟疾、锥虫病、利什曼病等[25]，抗菌肽可以将其有效地杀灭。疟原虫是疟疾的病原体，在疟原虫的无性血液阶段会导致发烧、贫血、死亡等疟疾临床表现的出现。Tonk等[26]研究发现，抗菌肽Mtk-1和Mtk-2在低浓度时就可抑制恶性疟原虫的生长，且对猪和小鼠的红细胞显示出低溶血作用，表明Mtk-1和Mtk-2可被视为针对恶性疟原虫无性血液阶段重要的抗寄生虫药物开发的先导。Liu等[27]研究发现，抗菌肽HPRP-A1/A2通过破坏弓形虫速殖子的结构并诱导保护性免疫应答从而有效地对抗弓形虫的感染。

2.5 抗肿瘤功能

对于癌症细胞株，抗菌肽能选择性地杀灭癌细胞，但对正常细胞无毒害作用[28]。Sang等[29]研究发现，抗菌肽ABP-dHC-Cecropin A及其类似物在白血病细胞中均具有浓度依赖性的细胞毒性作用，而对非癌细胞系则无细胞毒性。Athanasios等[30]将具有抗癌和抗菌活性的特定基因序列IIKK和LLKKL插入到抗菌肽Cathelicidin LL-37的17～29片段中，发现该合成肽对支气管上皮癌细胞有实质性细胞毒性，对人红细胞无细胞毒性。

2.6 免疫学功能

大多数抗菌肽在体内的合成浓度远低于其最小抑菌浓度，这些研究表明，有些抗菌肽具有招募趋化因子、激活免疫细胞、抗炎及提高机体抗感染的能力，能起到免疫调节的作用[31]。此外，有些抗菌肽能加速免疫和伤口愈合过程[32]。张守平等[33]表明，抗菌肽能影响嗜中性粒细胞呼吸暴发反应，通过凝集病毒能力的提高，从而使嗜中性粒细胞摄入病毒的能力提高。目前对抗菌肽免疫功能的研究还比较分散，对抗菌肽在生理环境下调控机体免疫功能的具体机制还有待深入研究。

3 抗菌肽在动物生产中的应用

3.1 作为绿色饲料添加剂的应用

近年来，由于抗生素在动物生产过程中的过度使用，导致动物机体紊乱，肠道微生态平衡被破坏，动物机体的自身抵抗力下降，同时也导致动物产品和环境中出现大量抗生素残留，使致病菌的耐药性增强，危害人类健康。由于抗菌肽具有多种生物学活性，易消化吸收，耐酸碱、耐热等，因此可作为抗生素替代品添加在畜禽饲料中。作为新型绿色饲料添加剂，抗菌肽可以提高动物生产性能、增强动物免疫力、改善动物肠道形态和盲肠菌群结构[34]，对营养物质的吸收利用具有促进作用，目前已经在许多动物生产中得到应用。

3.1.1提高生产性能及产品品质抗菌肽作为一种新型高效的绿色饲料添加剂不会在畜禽体内产生残留，并对畜禽生产性能和产品品质的有效提升有十分积极的意义。侯佳妮等[35]研究表明，鲎素抗菌肽能延缓产蛋后期蛋鸡产蛋率的下降幅度，改善蛋品质。徐帆等[36]报道，抗菌肽可提高断奶仔猪的生长性能和免疫活性指标。董晓庆等[37]研究发现，抗菌肽对建鲤肌肉中蛋白质含量具有提高的作用，并且能改善肌肉品质。Liu等[38]研究表明，抗菌肽能提高幼山羊的平均日增重，增加果胶酶、木聚糖酶和脂肪酶的酶活性，导致体重增加，并影响瘤胃发酵功能。付义凯等[39]报道，禽类β-防御素在保护精子的作用方面具有一定的特殊性。

3.1.2提高畜禽免疫力在饲料中添加抗菌肽可使动物的免疫能力有所提高。王莉等[40]研究表明，在817肉杂鸡的日粮中添加天蚕素抗菌肽可以提高免疫器官指数、ND抗体水平和T淋巴细胞转化率。袁威等[41]发现在断奶仔猪的日粮中添加1 000 mg/kg的复合抗菌肽不仅可以提高生长性能，同时还可提高血清中细胞因子的含量，提高免疫功能。胡世康等[42]研究表明，在饲料中添加适量的微生物抗菌肽S200可以提高凡纳滨对虾中超氧化物岐化酶、溶菌酶的活性，从而提高凡纳滨对虾的抗氧化能力和杀菌活性，增强其免疫功能，有助于凡纳滨对虾养殖成功。杨颜铱[43]研究表明，复合抗菌肽“态康利保”可提高川中黑山羊机体的细胞、体液免疫应答，从而提高山羊的免疫能力。

3.1.3杀菌抑菌，改善肠道菌群结构肠道菌群可维持机体的免疫和消化吸收功能，并能参与宿主代谢，促进动物生长发育。王建[44]发现，抗菌肽Api-PR19能显著减少饲养后期肉鸡盲肠有害菌大肠杆菌和空肠弯曲杆菌的数量，并在一定程度上维持了盲肠微生物的丰度，改善肠道健康。陈张华等[45]研究表明，在饲料中添加复合抗菌肽不仅能使断奶仔猪肠道内乳酸杆菌的数量增加，还能减少肠道大肠杆菌的数量，且最适添加量为1 000 mg/kg。Liao等[46]在抗菌肽对南美白对虾的影响研究中发现，多肽S100可以改善南美白对虾的生长性能和肠道菌群结构，并能提高抗菌和免疫功能。Ren等[47]通过在山羊饲料里添加不同剂量的抗菌肽与空白对照组做比较，发现饲喂抗菌肽的山羊其瘤胃微生物菌群结构得到改善，瘤胃发酵功能发生改变，并提高了饲料利用率。

3.1.4改善肠道形态，促进营养吸收肠道结构和形态的完整是机体正常消化吸收和维持动物健康的基础。Hu等[48]将猪肠道抗菌肽添加到肉仔鸡日粮中，发现能显著提高肉鸡生产性能，减少肠道损伤，并能改善和提高慢性热应激条件下的正常肠道结构、吸收功能和黏膜免疫。梁秀丽等[49]研究发现，抗菌肽APB-13可促进仔猪小肠形态发育，改善盲肠微生物菌群结构，从而提高仔猪生长性能，降低腹泻率。苏保元[50]比较了不同抗菌肽—天蚕素、表面活性素粗提品以及表面活性素发酵产物对斜带石斑鱼肠道组织结构的影响，结果表明，天蚕素和表面活性素均可增加肠黏膜皱襞高度和肌层厚度。

3.2 在疾病防治上的应用

目前关于抗菌肽在动物疾病防治如在断奶仔猪腹泻、奶牛乳房炎方面的研究报道较多。仔猪断奶可导致肠道功能系乱，出现腹泻、生长性能下降等现象，严重时会致使猪死亡，极大地阻碍了养猪业的健康发展。抗菌肽不仅可调节机体免疫，还具有保护肠道上皮屏障功能，可应用于防治断奶猪腹泻。Peng等[51]评估了重组猪β-防御素2(rpBD2)作为断奶仔猪的药用饲料添加剂的用途，发现在基础日粮中添加5 g/kg的粗制rpBD2不仅能增加十二指肠和空肠的肠绒毛高度，rpBD2还提高了仔猪盲肠黏膜微生物区系的一致性，降低了微生物区系的多样性，使细菌病原体更少，从而减少了断奶仔猪腹泻的发生。Shi等[52]研究发现，复合抗菌肽CAP能显著降低断奶仔猪的腹泻率。万遂如[53]报道，抗菌肽在猪病防治中用途广泛，可用于猪呼吸道病综合征、猪腹泻性疫病、母猪乳腺炎和子宫内膜炎、猪附红细胞体病等多种病毒以及细菌共感染和继发感染引发疾病的治疗，肌肉注射抗菌肽配合细胞因子疗法效果显著。

奶牛乳房炎是当今造成世界各国奶牛损失最大的一种疾病[54]，该病不仅会使产奶量和牛奶质量降低，还能引起严重的食品安全问题，而使用抗菌肽是治疗奶牛乳房炎的安全有效的手段之一。单玉雪等[55]研究发现，抗菌肽NZ2114对导致奶牛乳房炎的无乳链球菌和乳房炎临床分离株的抗菌活性分别是万古霉素2.91和6.09倍。Báez-Magaa等[56]发现从拟南芥中分离出的抗菌肽—硫蛋白Thi2.1通过诱导产生促炎和抗炎分子来调节牛乳腺上皮细胞的先天免疫反应，从而抑制金黄色葡萄球菌的侵袭感染。王静[57]利用致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染构建了奶牛乳房炎的动物模型，通过乳房灌注试验和乳房注射质粒试验证明重组牛LAP-CATHL2抗菌肽对奶牛乳房炎有良好的防治效果。

4 展 望

虽然抗菌肽在很多方面发挥着重要作用，但距离广泛应用还有许多问题需要解决，主要包括以下几个方面：1) 天然抗菌肽表达量低，重组抗菌肽分离纯化困难、只有少部分能进入生产实践阶段[58]且工业批量生产技术不成熟；2)虽然抗菌肽的热稳定性强，但易被动物胃肠道的多种蛋白酶和多肽酶降解，导致其使用方式受到限制，使用剂量问题也需要深入研究；3)抗菌肽具有广谱抗菌作用，虽然研究人员通过共轭修饰提高了天然抗菌肽的抗菌活性和靶向性等特性[59]，但不同种属抗菌活性不一，导致研究成本较高；4) 部分抗菌肽具有较强的细胞毒性以及溶血活性高，影响其在动物体内的表达，所以抗菌肽的安全性问题也同样值得我们具体研究。5) 目前提出的抗菌作用机制只是理论模型，且十分复杂，仍需对抗菌肽的作用机理进行探索与发现。相信随着基因工程和分子生物学的发展，运用更多的现代分子生物学技术和工程菌发酵技术在抗菌肽的合成、安全稳定性、作用机理等方面进行深入研究，将会研发出更多绿色、新型、高效的抗菌肽产品，使其更好地应用于畜牧生产实践中，为养殖户带来更多的经济效益。