高氏盆炎方五号方对慢性盆腔炎大鼠抗炎、抗粘连的作用及机制研究※

王楚然 高 慧 徐文君 郝艳红 陈十昔

(华北理工大学中医学院2017级硕士研究生，河北 唐山 063000)

慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease，CPID)近年来被称为盆腔炎性疾病后遗症(sequelae of pelvic inflammatory disease，SPID)，即急性盆腔炎失治、误治，或患者身体状况不佳、免疫系统较弱导致病程延长，但也有部分患者起病缓慢，无急性病史[1]。CPID主要临床表现为下腹部疼痛，伴有肛门和腰腹坠胀疼痛，白带增多、质稠、异味等，属中医学妇人腹痛、癥瘕、带下病、不孕等范畴。近年来CPID发病率呈逐渐上升趋势，其病因复杂，病情缠绵，治疗棘手[2-3]。现代医学主要是抗炎治疗，抗生素有一定作用，但患者易产生耐药性且常有副作用[4]。中医治疗CPID具有疗效明显、无副作用、无耐药性、给药方法多样等优势[5]，在抗炎、杀菌、调节免疫及镇痛等方面疗效确切[6]。高氏盆炎方系列方由高慧教授总结临床经验创立，各号方针对CPID不同证型，其中五号方具有活血化瘀、温经散寒、破瘀消癥功效，临床主要用于治疗寒凝血瘀型CPID。本实验通过观察高氏盆炎方五号方对CPID大鼠抗炎、抗粘连的作用机制，为其临床治疗CPID提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级健康雌性SD大鼠75只，12周龄，体质量200～250 g，由河北医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(冀)2013-1003。饲养于河北中医学院实验中心，室温23～25 ℃，勤通风，光照条件良好，自由摄食、饮水，垫料每3 d更换1次。

1.1.2 实验药物 高氏盆炎方五号方药物组成：丹参15 g，小茴香6 g，没药10 g，炮姜4 g，肉桂10 g，赤芍15 g，延胡索15 g，当归10 g，桃仁10 g，三棱10 g，蒲黄10 g，莪术10 g，五灵脂10 g。以上中药购自河北省石家庄市中医院中药房，由河北省石家庄市中医院制剂室将其煎熬浓缩成生药浓度为2.8 g/mL的中药溶液，保存在4 ℃冰箱中备用。少腹逐瘀颗粒(吉林敖东延边药业股份有限公司，国药准字Z20000041)，用蒸馏水配制成0.2 g/mL溶液，保存在4 ℃冰箱中备用；人胎盘组织液(湖南一格制药有限公司,国药准字S43020001)。

1.1.3 实验试剂及仪器 磷酸盐缓冲液(PBS)[生工生物工程(上海)股份有限公司]；戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司)；苯酚凝胶(河北中医学院药理学实验室)；4%多聚甲醛固定液(上海远慕生物科技有限公司)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(内含苏木素染液、分化液、伊红染液)(北京索莱宝科技有限公司)；人成纤维细胞生长因子2(FGF-2)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒、白细胞介素2(IL-2)ELISA检测试剂盒(南京嘉誉达生物科技有限公司)；FGF-2免疫组化试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；一抗工作液、二抗工作液(上海森雄科技实业有限公司)；总RNA试剂盒(美国OMEGA公司)；荧光定量试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；数码显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；酶标仪(MK3型，芬兰雷勃集团中国区总部)；实时荧光定量PCR仪(7500型，美国应用生物系统公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模及分组 75只SD雄性大鼠常规饲养7 d适应环境后，于第8 d清晨禁食，随机抽取10只为空白组，其余65只造模。使用2%戊巴比妥钠溶液50 mg/kg对大鼠进行腹腔麻醉，待麻醉满意后，将大鼠仰卧位固定，剪去手术区被毛，碘伏消毒，于大鼠下腹正中做切口，长约1 cm，从膀胱后找到子宫，暴露并固定，首先用注射器针头机械损伤大鼠左侧子宫内膜组织，再用1 mL注射器从子宫分叉处进针，向左侧子宫内注入苯酚凝胶配制的25%苯酚胶浆0.06 mL，之后立即夹闭针孔，同时垫高大鼠臀部偏向于右侧，防止苯酚胶浆流出，最后将子宫纳入腹腔，逐层缝合切口，碘酊消毒术区皮肤，伤口使用敷料覆盖包扎。造模后第10 d，随机抽取5只大鼠，开腹取子宫组织，光镜下见子宫壁增厚，正常组织被破坏，慢性炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主，表明CPID大鼠模型建立成功。将余下60只大鼠按照随机数字表法分为6组，即模型组、少腹逐瘀颗粒组、人胎盘组织液组及高氏盆炎方五号方高、中、低剂量组，每组10只。

1.2.2 给药方法 空白组自由食水；模型组予0.9%氯化钠注射液1 mL/100 g灌胃；高氏盆炎方五号方高中、低、剂量组分别予高氏盆炎方五号方28、14、7 g/kg灌胃；少腹逐瘀颗粒组予少腹逐瘀颗粒1.5 g/kg灌胃；人胎盘组织液组予人胎盘组织液1 mL/kg后腿大腿肌肉处注射。均每日1次，连续20 d。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 血清FGF-2、IL-2含量 于给药后第21 d清晨禁食，末次给药24 h后，予2%戊巴比妥钠溶液50 mg/kg对大鼠进行腹腔麻醉，麻醉后固定，采集腹主动脉血，静置，离心，取上清，分装低温保存备用，ELASA法测定血清FGF-2、IL-2含量，严格按试剂盒说明书操作。

1.3.2 子宫组织病理形态学 取大鼠子宫组织，分离多余脂肪，使用4%多聚甲醛固定液固定。脱水处理后，二甲苯透明，2次浸蜡，常规石蜡包埋，将每个子宫组织切成石蜡切片，然后做烘干处理，经HE染色，树脂封片，数码显微镜下(×200倍)观察子宫组织病理形态学变化。

1.3.3 FGF-2蛋白表达水平 大鼠子宫组织石蜡切片常规脱蜡至水化；恒温培育；热修复抗原90 s，PBS冲洗，每次3 min，重复3次；置于3%过氧化氢(H2O2)，37 ℃孵育10～15 min，PBS冲洗，每次3 min，重复3次；非免疫血清封闭40 min；滴加适当比例稀释过的一抗工作液过夜，PBS冲洗，每次3 min，重复3次；滴加二抗工作液，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，每次3 min，重复3次；滴加PBS，37 ℃孵育10～15 min，PBS冲洗，每次3 min，重复3次；用二氨基联苯胺(DAB)显色后常规脱水；透明；中性树胶封片。图像采集时，在特定的放大倍数下，尽量选择相同部位视野。镜下可见子宫细胞内出现棕黄色颗粒时为阳性表达。用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统细胞测量程序计算单位面积阳性细胞表达的平均光密度值(AOD)，AOD越大阳性细胞表达越强。

1.3.4 FGF-2 mRNA表达水平 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法测定FGF-2 mRNA表达水平。取出冻存的子宫组织，粉碎、摇匀，取细胞悬液加入总RNA提取试剂1 mL常规方法提取总RNA，取5 μL RNA样品测定浓度后，逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，按照荧光定量试剂盒说明书建立反应体系20 μL(包括cDNA模板1 μL，2×PCR PreMix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，50×TOX ReferenceDye 0.4 μL，去核糖核酸酶(RNase)的水6.6 μL)，反应参数设置如下：预变性95 ℃ 10 min，然后(95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s)×40个循环反应。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，用实时荧光定量PCR仪对cDNA扩增，获得qRT-PCR反应曲线，FGF-2基因Ct值-GAPDH基因Ct值=ΔCt，计算每个目的基因的Q值及Q均值(按照公式Q=2-ΔCt)，最后求出RQ值(RQ=Q值/Q均值)，将RQ值统计分析。扩增的目的基因引物序列和片段长度见表1。

表1 扩增的目的基因引物序列和片段长度

2 结果

2.1 各组大鼠子宫组织病理形态学变化 光镜下空白组大鼠子宫各层界限清楚，腺体规整，未见炎症细胞浸润。模型组大鼠宫腔扩张处子宫壁变薄，增生明显处子宫壁增厚，腺体被破坏，有内膜上皮脱失现象，部分成纤维细胞增生，全层皆可见大量炎症细胞浸润。高氏盆炎方五号方高剂量组大鼠宫腔扩张程度明显轻于模型组，上皮细胞形态趋于正常，内膜基本无充血水肿，炎症细胞明显减少。高氏盆炎方五号方中剂量组大鼠宫腔扩张程度明显轻于模型组，子宫腔壁结构正常或稍增厚，大部分腺体恢复正常，稍有内膜充血、水肿，成纤维细胞增生不明显，少量炎症细胞浸润。高氏盆炎方五号方低剂量组大鼠宫腔扩张程度轻于模型组，肌层结构较紊乱，部分内膜充血、水肿，上皮细胞形态可见增生样变，较多炎症细胞浸润。少腹逐瘀颗粒组大鼠子宫组织病理形态学变化与高氏盆炎方五号方低剂量组相似。人胎盘组织液组大鼠宫腔扩张程度明显轻于模型组，子宫组织结构稍清晰，上皮细胞增生现象减少，间质细胞轻度水肿，腺体较完整，少量炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠子宫组织病理形态学(HE，×200)

2.2 各组大鼠血清FGF-2、IL-2含量比较 见表2。

由表2可见，模型组FGF-2含量高于空白组(P<0.05)，IL-2含量低于空白组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方高、中、低剂量组及少腹逐瘀颗粒组、人胎盘组织液组FGF-2含量均低于模型组(P<0.05)，IL-2含量均高于模型组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方高、中剂量组FGF-2含量均低于少腹逐瘀颗粒组(P<0.05)，IL-2含量均高于少腹逐瘀颗粒组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方低剂量组、少腹逐瘀颗粒组FGF-2含量均高于人胎盘组织液组(P<0.05)，IL-2含量低于人胎盘组织液组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方高、中剂量组FGF-2含量均低于高氏盆炎方五号方低剂量组(P<0.05)，IL-2含量均高于高氏盆炎方五号方低剂量组(P<0.05)；空白组、高氏盆炎方五号方高、中剂量组及人胎盘组织液组FGF-2、IL-2含量两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠血清FGF-2、IL-2含量比较

2.3 各组大鼠子宫组织FGF-2蛋白表达的AOD比较 见表3。

表3 各组大鼠子宫组织FGF-2蛋白表达的AOD比较

由表3可见，模型组FGF-2蛋白表达的AOD高于空白组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方高、中、低剂量组及少腹逐瘀颗粒组、人胎盘组织液组FGF-2蛋白表达的AOD均低于模型组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方高、中剂量组FGF-2蛋白表达的AOD均低于少腹逐瘀颗粒组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方低剂量组、少腹逐瘀颗粒组FGF-2蛋白表达的AOD均高于人胎盘组织液组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方高、中剂量组FGF-2蛋白表达的AOD均低于高氏盆炎方五号方低剂量组(P<0.05)；空白组、高氏盆炎方五号方高、中剂量组及人胎盘组织液组FGF-2蛋白表达的AOD两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 各组大鼠子宫组织FGF-2蛋白表达(免疫组化，×400)

2.4 各组大鼠子宫组织FGF-2 mRNA表达水平比较 见表4。

由表4可见，模型组FGF-2 mRNA表达水平高于空白组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方高、中、低剂量组及少腹逐瘀颗粒组、人胎盘组织液组FGF-2 mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方高、中剂量组FGF-2 mRNA表达水平均低于少腹逐瘀颗粒组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方低剂量组、少腹逐瘀颗粒组FGF-2 mRNA表达水平均高于人胎盘组织液组(P<0.05)；高氏盆炎方五号方高、中剂量组FGF-2 mRNA表达水平均低于高氏盆炎方五号方低剂量组(P<0.05)；空白组、高氏盆炎方五号方高、中剂量组及人胎盘组织液组FGF-2 mRNA表达水平两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表4 各组大鼠子宫组织FGF-2 mRNA表达水平比较

3 讨论

CPID是妇科常见病和多发病，也是引起盆腔粘连的最常见原因之一[7]，其反复发作、经久不愈的特点严重影响妇女身心健康，增加家庭和社会负担[8]。CPID临床症状多以下腹刺痛或坠痛为主，经期、性生活后及劳累后加重，月经色黯有块，舌质黯有瘀斑，脉涩等血瘀证症状。高教授根据多年临床经验认为，血瘀是CPID的核心病机，寒凝血瘀证是常见证型。高氏盆炎方五号方将少腹逐瘀汤、宫外孕Ⅱ号方(丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术)两方化裁合用，在温阳化瘀基础上增强破瘀消癥作用，形成以活血化瘀消癥为主，兼温经止痛的治疗大法。方中赤芍、蒲黄、五灵脂、丹参、桃仁、三棱、莪术、没药活血祛瘀消癥为主，小茴香、炮姜、延胡索、当归、肉桂温经理气止痛为主，诸药合用，攻补兼施，行气破血，调达气机，消癥散结，活血化瘀，消肿止痛，温经散寒，扶正祛邪，为妇科治疗CPID的有效方剂。现代医学研究发现，具有活血化瘀作用的药物能改善微循环，增强细胞免疫及体液免疫作用，使纤维蛋白溶解酶活性增强，粘连松解，从而达到治疗CPID目的[9-10]。

高教授提出盆腔炎有湿性炎症和干性炎症不同，急性盆腔炎多是以渗出为主的“湿性炎症”，CPID多是以增生、粘连为主的“干性炎症”，故CPID所致盆腔粘连是亟待解决的问题。FGF-2过度表达可促进炎症组织中成纤维细胞的过度增殖与分化，合成大量胶原纤维，是与CPID密切相关的粘连相关细胞因子。研究发现，CPID模型大鼠子宫组织中若发生炎症和粘连可表现为FGF-2表达增高[11]。FGF-2也是加快血管生成的因子，修复血管同时会使子宫组织的纤维化与粘连更加严重，同时它也发挥了促炎作用，诱导炎症因子和自由基产生，加重炎性反应[11-12]。IL-2参与炎性反应和免疫反应，是机体重要的抗炎生化标志物，激发免疫效应器细胞，参与抗体反应，起到明显的抗炎作用，还可调节免疫功能，增强人体自身的抗感染能力[13-14]。

本实验结果显示，模型组大鼠血清FGF-2水平和子宫组织FGF-2蛋白及FGF-2 mRNA表达水平明显升高，血清IL-2水平明显降低，与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，提示FGF-2过度表达，促进炎症组织中成纤维细胞的过度增殖与分化，抗炎因子IL-2表达被抑制，加重炎性反应。经治疗，高氏盆炎方五号方高、中、低剂量组血清FGF-2水平和子宫组织FGF-2蛋白及FGF-2 mRNA表达水平降低，血清IL-2水平升高，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，高氏盆炎方五号方高、中剂量组与空白组、人胎盘组织液组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，说明高氏盆炎方五号方可有效降低FGF-2在CPID大鼠血清和子宫组织中水平，升高血清中IL-2含量，从而减轻大鼠子宫组织的纤维化和瘢痕，防止和减少粘连，提高自身抗炎能力，并可减轻慢性炎症的严重程度。其中高氏盆炎方五号方高、中剂量组等效，治疗效果最突出，高氏盆炎方五号方低剂量组疗效次之，可能是剂量不足所致。

综上所述，高氏盆炎方五号方对CPID大鼠可起到抑制炎症发展、促进炎症吸收及抗组织粘连作用，其机制可能与下调FGF-2水平、上调IL-2水平有关。