基于内皮细胞自噬探讨紫色疽疮膏治疗糖尿病足血瘀型慢性创面的作用机制※

王广宇 王 雨 王雷永 徐旭英

(首都医科大学附属北京中医医院疮疡血管外科，北京 100010)

与糖尿病有关的疮面，在破溃前已经有隐性损伤，破溃后愈合过程中常停滞于某一阶段，从而影响了正常的愈合过程，转变为难愈合的慢性创面，是临床上的治疗难点之一[1]。中医在慢性创面局部辨证方面经验丰富，其中局部具有颜色黯、生长乏力、渗出较少特点的疮面，属于血瘀型疮面[2-3]。局部微循环障碍是血瘀型创面发生原因之一，由于某些因素如炎症因子、细菌感染等导致暂时性血管舒缩功能失调，从而引起局部供血不足缺血，改变创面微环境，改善微循环，对创面愈合无疑是必要和有效的[4-5]。近年来自噬诱导对内皮细胞收缩功能的调控逐渐得到认可[6]。紫色疽疮膏是我们治疗糖尿病足血瘀型慢性创面的经验方，本研究通过观察紫色疽疮膏对内皮细胞自噬作用的影响，探讨其治疗糖尿病足血瘀型慢性创面的作用机制。

1 资料与方法

1.1 病例选择

1.1.1 诊断标准 糖尿病足慢性创面的诊断参照《国际糖尿病足工作组糖尿病足慢性创面处理指南》中的相关诊断标准[7]，糖尿病足溃疡病程>4周不能愈合，且也无明显愈合趋势。局部血瘀证参照《中药新药临床研究指导原则(试行)》中辨证标准[8]：创面溃烂经久，基底呈黯红色或紫黯色，渗出物较少或干枯无脓，腐肉少许或腐肉虽脱，但新肉难生，创周肤色黯无红肿。

1.1.2 纳入标准 符合上述诊断标准；糖尿病足Wagner分级[7]2～3级，创面面积4～10 cm2；患者签属知情同意书，并自愿参加本研究，经过医院医学伦理委员会批准。

1.1.3 排除标准 排除放射性、结核性及癌性创面；排除由于动脉粥样硬化闭塞症导致的创面溃疡者；合并有恶性肿瘤、急性心脑血管意外、肾功能不全、严重肝脏损伤等疾病者。

1.2 一般资料 共纳入5例患者，男3例，女2例，年龄44～73岁，糖尿病病程5～21年，糖尿病足病程4个月～6年。

1.3 治疗方法 单纯采用紫色疽疮膏(以龙血竭为主药，还包括轻粉、红粉、琥珀粉、乳香粉、冰片、煅珍珠粉，由首都医科大学附属北京中医医院制剂室加工成膏剂)外敷治疗，每日1次。

1.4 皮肤标本选择及保存 5例患者分别在治疗前及治疗3、6 d后局部蚕食清创换药时留取适量创面组织标本，作为治疗组。另选取肢体近端正常皮肤真皮浅层组织，作为正常对照组。2组组织分为2部分，一部分立即置于-80 ℃冰箱保存，其余放入10%中性福尔马林溶液中保存，进行脱水、固定、石蜡包埋。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 微血管内径 对皮肤真皮浅层微血管内皮细胞进行CD34免疫组织化学染色和免疫荧光四重染色[包括CD68、CD34、增殖细胞核抗原(PCNA)及α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)]，观察皮肤真皮浅层微血管内径变化情况。取上述石蜡包埋组织，切片后进行CD34免疫组织化学染色，再用日本Olympus公司CX41-12C02型光学显微镜进行观察，CD34免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，严格按照试剂盒说明操作。取-80 ℃冰箱保存组织，按文献[9-10]中的方法进行免疫荧光四重染色，再用日本Olympus公司CX31-32RFL型荧光显微镜进行观察，其中TSA plus免疫荧光试剂盒、一抗、二抗及荧光素均由美国PerkinElmer公司提供，小鼠抗人CD68、CD34、PCNA及αSMA抗体由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，严格按照试剂盒说明操作。均采用德国Carl Zeiss公司ZEN显微图像分析系统观察及测量微血管内径。

1.5.2 细胞自噬 采用免疫组织化学染色法对膜型微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)染色观察。取上述石蜡包埋组织，切片后进行LC3Ⅱ免疫组织化学染色，常规光学显微镜观察完毕后换用高倍油镜观察，LC3Ⅱ免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，严格按照试剂盒说明操作。采用蛋白质免疫印迹法对创面组织中LC3Ⅱ/胞浆型微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅰ)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白含量进行测定，采用美国Thermo Fisher Scientific公司MultiSkan MK3酶标仪进行检测和拍照，相关试剂盒购自天津锐尔康生物科技有限公司，计算靶蛋白的积分光密度值，并与β-actin内参蛋白进行比较，计算靶蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 2组皮肤真皮浅层微血管内径比较 见表1、图1。

表1 2组皮肤真皮浅层微血管内径比较

注：A～D为免疫组织化学染色；E～H为免疫荧光四重染色，其中红色为CD68+细胞，绿色为CD34+细胞，蓝色为PCNA+细胞，紫红色为αSMA+细胞

由表1、图1可见，免疫组织化学染色和免疫荧光四重染色结果均显示，与正常对照组比较，治疗组治疗前皮肤真皮浅层微血管内径明显增大，比较差异有统计学意义(P<0.05)。与治疗组治疗前比较，治疗组治疗3、6 d后皮肤真皮浅层微血管内径均明显缩小，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，治疗组治疗3 d后与治疗6 d后比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 2组创面组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、eNOS及p-mTOR蛋白表达水平比较 见表2、图2。

表2 2组创面组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、eNOS及p-mTOR蛋白表达水平比较

注：1正常对照组；2治疗组治疗前；3治疗组治疗3 d后；4治疗组治疗6 d后

由表2、图2可见，与正常对照组比较，治疗组治疗前创面组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表达水平明显降低，eNOS蛋白表达水平明显升高，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与治疗组治疗前比较，治疗组治疗3、6 d后创面组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表达水平明显升高，eNOS蛋白表达水平明显降低，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，治疗组治疗3 d后与治疗6 d后比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 2组LC3Ⅱ免疫组织化学染色结果 在低倍光镜下观察，治疗组治疗前及正常对照组皮肤真皮浅层微血管内皮细胞LC3Ⅱ均呈现蓝染，并且正常对照组蓝染较深，治疗组蓝染较淡。治疗组经紫色疽疮方治疗后3、6 d后染色有所增加，但浅于正常对照组。在高倍油镜下观察发现，2组LC3Ⅱ为蓝染的颗粒状，较集中于细胞核部及周围，并向外呈辐射状排列，呈细小的颗粒状[11]。正常对照组LC3Ⅱ蓝染颗粒较多且颜色较深，治疗组治疗前LC3Ⅱ蓝染颗粒少且颜色较浅，而经紫色疽疮方治疗后3、6 d后LC3Ⅱ蓝染颗粒有所增加，颜色加深。见图3。

注：A～D为光镜×200观察结果；E～H为油镜×1000倍观察结果；I～L为油镜局部放大图

3 讨论

创面的修复是一个复杂过程，主要包括炎症期、增殖期及组织重塑期3个阶段，任何一个阶段出现异常都可导致创面的修复异常，其中过度炎性反应导致的血管生成紊乱、微血管功能障碍、上皮化异常等是创面难愈合的主要原因[12]。自噬是细胞内的降解系统,自噬小泡可以包裹衰老或受损的细胞器,将其运输至溶酶体进行消化，降解的物质可再循环利用，并可通过多种途径调整细胞功能，对维持内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞稳态及创面修复具有重要作用[13]。近年来，自噬在慢性创面内皮细胞功能调节中的作用逐渐得到重视。研究表明，糖尿病足溃疡疮面中内皮细胞自噬水平明显低于未溃皮肤中内皮细胞自噬水平，疮面中的自噬被明显抑制[14]。LC3是自噬过程的标志物，主要参与了自噬小体的形成，自噬发生时LC3前体分子首先裂解形成胞质形式的LC3Ⅰ，然后再降解以膜结合形式的LC3Ⅱ附着到自噬体膜上，LC3Ⅰ与LC3Ⅱ存在一个生成与降解的动态过程，因此临床通常以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值评估自噬水平的高低[14]。自噬的激活过程受多种基因和信号通路的调控，mTOR作为细胞内中心信号调节因子，可接受激素、能量、营养、氧化应激、生长因子等多种信号的刺激，对细胞自噬的大多数信号传导通路呈负性调控。mTOR可抑制自噬起始分子ULK1的活性，从而实现对自噬的调控，但当其磷酸化为p-mTOR后，可解除对ULK1的抑制，从而诱导细胞自噬产生系列的生理活动[15]。一氧化氮(NO)是调节内皮细胞舒缩的主要物质，其合成酶主要为一氧化氮合酶(NOS)，eNOS就是存在于内皮细胞中的NOS，当其激活时eNOS利用L-精氨酸和氧产生NO从而舒张血管，使血管内径增加[16]，而自噬可以调控eNOS水平，从而调控血管的舒缩，也是调节舒缩功能的主要途径[17]。本研究结果显示，治疗组治疗前LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白水平较正常对照组明显降低(P<0.05)，也说明了内皮细胞自噬水平受到抑制，eNOS水平较正常对照组明显升高(P<0.05)，进而也导致了皮肤真皮浅层微血管内径较正常对照组明显增加(P<0.05)。但另有研究认为，诱导自噬后可使eNOS表达增加，而自噬水平降低伴随着eNOS表达的下调[18]，与本研究结果相左，其原因不明，可能与本研究所选的均为血瘀型慢性创面有关，其具体原因需要进一步研究。

糖尿病足慢性创面的愈合问题一直是临床治疗的难点，中医学认为其发生与气、血关系密切，机体气虚和局部血瘀是导致创面迁延难愈的根本原因[19-20]。糖尿病足病程日久，创面长期难以愈合或反复发作，耗伤人体气血，气虚则行血无力，血虚则不能滋养筋骨四肢，造成血流迟缓，经脉失养，气血瘀滞，血脉扩张，久郁化热，热瘀结合，蕴结肌肤，腐蚀筋肉进而导致创面难愈。紫色疽疮膏是我们临床治疗糖尿病足血瘀型慢性疮面的经验方[21]，方中重用龙血竭活血定痛，化瘀止血，敛疮生肌；琥珀粉、乳香粉增强化瘀之力；红粉、轻粉味辛，可拔毒提脓，祛腐生肌；冰片辛寒，通诸窍，散郁火，消肿止痛，增加通散之功；珍珠粉解毒生肌，敛疮止痒。诸药合用，以活血化瘀为重点，佐以解毒敛疮、祛腐生肌，则络通、瘀散、腐去、肉生。现代药理学研究表明，龙血竭中主要成分龙血素A、龙血素B具有促进大鼠急性皮肤创伤愈合的作用，能通过参与调控P物质和Bcl-2的表达,增加细胞增殖和减少细胞凋亡，有效地促进糖尿病烫伤创面的愈合，此外龙血竭还有抗菌、抗炎、降血糖、降血脂、抗肿瘤等功效[22-24]。本研究结果显示，治疗组治疗3、6 d后创面组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表达水平较治疗前明显升高(P<0.05)，eNOS蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，皮肤真皮浅层微血管内径明显缩小(P<0.05)。

综上所述，紫色疽疮膏治疗糖尿病足血瘀型慢性创面疗效确切，其作用机制可能与增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表达水平，降低eNOS蛋白表达水平，提高内皮细胞自噬水平有关，可改善血管内皮细胞的舒缩功能，改善创面局部血管扩张淤滞状态，改变局部微环境，促进血液循环，促进新陈代谢，进而促进创面的生长和修复。然而创面修复毕竟是一个十分复杂的过程，中药也具有多重的生物功效，紫色疽疮膏对其治疗是否还存在其他的作用途径，有待将来进一步观察研究。