衍生化气相色谱-质谱法测定复垦土地样品中19种酚类污染物

李忠煜，李艳广，黎卫亮，汪双双，赵江华

（中国地质调查局西安地质调查中心，陕西 西安710054）

土地复垦是指对在生产建设过程中，因挖损、塌陷、压占等造成破坏的土地，采取整治措施，使其恢复到可供利用状态的活动［1］，主要涉及矿产资源开采、化工产业、燃煤发电等［2-3］。复垦土地样品的特点是样品基质复杂，干扰因素较多，前处理困难，污染物种类多，迁移规律复杂，各类指标检出率高［4-5］。随着“绿水青山”的理念深入人心，全社会对环保的重视程度越来越高，复垦土地的质量评价中对各类污染物检出限的要求也更加严格［6-7］。目前各类污染物指标中，酚类污染物的色谱直接检测方法，存在色谱响应值低、易挥发、稳定性与回收率差等问题［8］。低浓度样品测定难度较大，有待研究改进。

酚类化合物是一类中等强度的化学毒物，与细胞原浆中的蛋白质发生化学反应［9］，可经皮肤粘膜、呼吸道及消化道进入体内［10-11］。低浓度可引起蓄积性慢性中毒，高浓度可引起急性中毒以致昏迷死亡［12-13］。环境中的酚污染主要是指酚类化合物对水体土壤的污染，含酚废水是当今世界危害大、污染范围广的工业废水之一［14］。在许多工业领域诸如采矿、焦化、炼油、冶金、石油化工、化学合成业、医药、农药、油漆等工业排出的废水中均含有酚类化合物［15］。

根据酚类化合物的性质，可采用气相色谱、液相色谱、气相色谱-质谱联用法［16-18］以及4-氨基安替比林分光光度法［19］（HJ/T 32—1999）对其进行测定。其中，气相色谱法［20-21］的方法检出限为10～60 μg/kg，液相色谱法［22-23］的方法检出限为10～50 μg/kg，气相色谱-质谱法［24-26］的方法检出限为9.60～480μg/kg。可见，直接测定的检出限较高且范围较宽，难以满足痕量检测的需要。酚类化合物在气相色谱检测器或质谱上的响应值比较低，为实现更低的检出限，可采用衍生化的方法进行测定［27］。常见的衍生化方法有：酰化衍生，多采用七氟丁酸酐或者乙酸酐作为衍生试剂［28-29］；烷基化衍生，试剂主要为重氮甲烷、五氟苄基溴（PFB）［30-31］；硅烷基化衍生，常用的试剂为三甲基硅烷（TMS）［32-33］；溴化反应，采用酸性条件下KBr-KBrO3溶液为衍生化试剂［34］。各衍生化试剂都可以提高酚类的色谱相应值，同样也各有缺点，如三甲基衍生物不稳定、易分解；酰化、溴化反应衍生物对色谱柱有伤害；五氟苄基溴对人有刺激性等。本文针对复垦土地样品基质复杂、干扰因素多、前处理困难等特点，对该类样品的提取与净化方法进行筛选优化。根据酚类污染物检测中检出限高、范围大、重现性差等问题，通过衍生化与非衍生化效果的对比、衍生化条件优化、实际样品测定等方面，建立了复垦土地样品酚类污染物的衍生化气相色谱-质谱检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器和主要试剂

ASE350加速溶剂萃取仪（美国ThermoFisher公司）：配24位萃取盘，不锈钢萃取池。

TRACE2000 DSQ 气相色谱-质谱仪（美国ThermoFisher公司）：配色谱柱（长30m，内径0.25mm，固定相液膜厚度0.25μm，固定相为5% -苯基-甲基聚硅氧烷）。

酚类化合物混合标准溶液：浓度为1000mg/L（美国O2si smart solutions公司）。替代物标准溶液：两种替代物混合标准溶液，浓度为1000mg/L（美国O2si smart solutions公司）。内标：苊-d10，浓度为1000mg/L（美国O2si smart solutions公司）。

衍生化试剂：五氟苄基溴（C7H2BrF5），规格为5g，98%（Alfa Aesar公司）。ρ＝0.05g/mL。称取0.5g五氟苄基溴，溶于丙酮，并定容在10.0mL容量瓶中，4℃下避光冷藏，待用。

碳酸钾溶液（ρ＝0.1g/mL）：称取1g碳酸钾（丙酮浸泡清洗并氮气吹干）溶于水中，定容至10.0mL，待用。

无水硫酸钠、粒状硅藻土：置于马弗炉中450℃烘4h，冷却后装入干燥器中保存。

正己烷、丙酮、二氯甲烷等均为色谱纯（美国J.T.Baker公司）。

1.2 实验样品

复垦土地样品：采自陕西某金属矿区的复垦土地。采集地表50cm以下、粒径小于0.425mm的土壤样品。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

索氏提取［35-36］：称取5g土壤样品，加入替代物使用液，所有样品转入纸质套筒，置于索氏提取器回流管中，在圆底溶剂瓶中加入120mL正己烷-丙酮（体积比1∶1）混合溶剂，提取16～18h，回流速度控制在每小时4～6次，收集提取液。

超声波提取［37-38］：称取5g土壤样品，加入替代物使用液，添加30mL正己烷-丙酮（1∶1）混合溶剂，所有样品加入具塞比色管中，超声提取15min，将提取液倒入氮吹瓶中，再次添加30mL正己烷-丙酮（1∶1）混合溶剂，超声提取15min，然后加入20mL正己烷-丙酮（1∶1）混合溶剂洗涤一次，合并提取液。

加速溶剂萃取［39-41］：称取5g土壤样品于34mL萃取池中，加入替代物使用液，加入填充剂（粒状硅藻土）与干燥剂（无水硫酸钠）。萃取溶剂为正己烷-丙酮（1∶1）混合溶液，温度100℃，压力1500psi，静态萃取时间5min，溶剂淋洗体积为60%池体积，循环2次，吹扫时间60s，收集提取液。

旋转蒸发浓缩：将萃取液转入合适体积的圆底烧瓶，浓缩至2mL左右，转出提取液，用正己烷清洗3次圆底烧瓶，溶液转移至浓缩管合并。再用小流量氮气浓缩至3～5mL，待衍生化。

氮吹浓缩：萃取液转入浓缩管中，开启氮吹浓缩。氮吹过程中应将已经露出的浓缩器管壁用正己烷反复多次洗涤。浓缩至3～5mL，待衍生化。

衍生化：在浓缩液中加入100μL五氟苄基溴溶液（ρ＝0.05g/mL）和100μL碳酸钾溶液（ρ＝0.1 g/mL），混匀。加入丙酮使之达到8mL左右，置于60℃水浴中，保持60min，冷却至室温。继续氮吹浓缩，加入内标液，定容至1.0mL，待测。

净化：如萃取液浑浊或颜色很深，则需要净化，可采用小柱净化法［42-43］。具体如下：先用12mL 10%正己烷-二氯甲烷淋洗硅酸镁小柱（1g/6mL），再用12mL正己烷淋洗，在液面消失前，将萃取液的浓缩液转移至净化柱中，用少量正己烷洗涤浓缩瓶，洗涤液一并转移至净化柱上（注意应始终保持填料上方留有液面），再用12mL 10%正己烷-二氯甲烷洗脱样品，收集于试管中。

1.3.2 气相色谱-质谱分析条件

毛细管色谱柱HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm。气相色谱条件：进样口温度260℃；载气为氦气，流速1.0mL/min；不分流进样，进样量1.0μL。升温程序：初始温度55℃，保持1min，以6℃/min升温至230℃，保持5min。

质谱条件：接口温度250℃；离子源温度250℃；电离方式为电子轰击电离（EI）；电离能量70eV；溶剂延迟15min；选择离子（SIM）模式。

表1 各组分保留时间、定量离子与辅助离子Table 1 Retention time，quantitative ions and auxiliary ions of each component

各化合物的出峰顺序与特征离子见表1与图1（其中2，4，6-三氯苯酚和2，4，5-三氯苯酚，以及2，3，4，5-四氯酚和2，3，5，6-四氯酚，因无法分离而合并计算），标准曲线见表2。

1.3.3 质量控制

所使用的有机试剂均应浓缩后进行空白检查（浓缩倍数视分析过程中最大浓缩倍数而定），试剂空白测试结果中目标物浓度应低于方法检出限。用处理过的硅藻土代替样品，与实际样品同步分析。测定结果中目标物浓度应不超过方法检出限。①基体加标样品。加标回收率范围应在70% ～130%之间。每个样品在称取之后、处理之前都应加入一定量的替代物，应确定替代物回收率在70% ～130%之间。②重复样检查。两个重复样品结果偏差应≤20%，低于方法检出限的不计。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法筛选

通过对三种前处理方法的方法检出限、测定下限、加标回收率、精密度，以及各方法在实际操作中的特点进行全面比较，筛选出更合适的前处理方法。

图1 酚类化合物衍生物总离子流图Fig.1 Total particle flow diagram of phenolic compounds derivatives

表2 酚类化合物标准曲线Table 2 Calibration curves of phenolic compounds

分别采用索氏提取、超声波提取、加速溶剂萃取（ASE）处理加标后的空白样品（加标浓度为10 μg/kg），分别将三种方法所得提取液浓缩，经硅酸镁小柱净化，然后进行衍生化处理，最后浓缩并加入内标物定容至1mL。测定并计算酚类化合物的方法检出限与测定下限（表3）。其中ASE方法的检出限最低，检出限范围最小。原因可能是ASE的提取过程都是在密闭条件下进行，没有外界干扰，且整个过程由仪器自动完成，样品处理之间差异相对最小。

在空白土壤样品中加入一定量的酚类化合物标准品与替代物。使其理论浓度为40μg/kg。称取5g样品，分别采用索氏提取、超声波提取、加速溶剂萃取对样品进行前处理，每种方法重复6次，比较加标回收率与结果精密度（表3）。三种处理方法均能满足试验要求，综合比较三种方法的精密度与回收率，ASE处理的效果最好，RSD最小，重现性最好，回收率最高。索氏提取次之，超声提取最差。又因为索氏提取耗时最长，消耗溶剂最多，因此选择ASE为最佳前处理方法。

2.2 衍生化与非衍生化对比

气相色谱或气相色谱-质谱联用分析酚类化合物，在不衍生情况下，表现在色谱图上的响应值比较低，各组分峰面积（峰高）差距很大。配制标准曲线的最低浓度一般为1～5mg/L，导致各组分的检出限不够低，差距也很大，导致检出限范围非常宽泛，甚至相差一个数量级以上。而衍生后信号强度较高，峰高更均衡（图1），检出限范围更为合理。

根据文献与相关标准方法记载，非衍生化检测酚类化合物的检出限一般在10～80μg/kg的范围之内。例如，《全国土壤污染状况详查 土壤样品分析测试方法技术规定》发布稿中提到的酚类化合物检出限为20～80μg/kg。杨丽莉等［20］采用超声波提取气相色谱法测定土壤中21种酚类化合物，检出限为10～60μg/kg。本文按照上述方法，采用ASE处理加标后的空白样品（加标浓度分别为200μg/kg、10μg/kg）。重复7次，测定并计算方法检出限，得到非衍生酚类化合物检出限为12.5～51.0μg/kg，衍生化检出限为0.67～3.95μg/kg。衍生化之后，虽然增加了分析步骤，但方法检出限以及精密度明显优于非衍生方法。

表3 三种提取方法的检出限、测定下限与精密度与回收率情况Table 3 Detection limit，determination lower limit，precision and recovery of the three extraction methods

2.3 衍生化方法优化

2.3.1 衍生化试剂的选择

酚类化合物的衍生化思路有烷基化、酰基化、硅烷基化等［27］。常用的衍生化试剂有五氟苄基溴、三甲基硅烷、四氯邻甲氧基苯酚等。各类衍生化试剂各有优劣，但都能满足测试要求。已有研究［28-34］表明，三甲基硅烷衍生物具有热稳定好、挥发性强、易于制备及色谱性能好等优点。但三甲基衍生物对水和酸不稳定，易分解，容易被提取液中水分影响。酰化反应的效果也很好，但使用的试剂对仪器及色谱柱的伤害较大。烷基化衍生检测法比较成熟，常用衍生试剂为五氟苄基溴，其缺点是衍生物在质谱中基峰单一，不利于定性。另外，五氟苄基溴为有毒化学试剂，对检测人员的眼睛具有较强的刺激性。其中，五氟苄基溴衍生物的缺点较容易解决，操作时可保持佩戴手套、护目镜并在通风柜中进行。综合分析，三种方法各有优劣，考虑到测定准确性与色谱柱寿命等方面，本方法选用五氟苄基溴作为衍生化试剂。

2.3.2 衍生化温度的优化（两种替代物）

分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃温度下进行衍生化反应，时间控制在1h。利用两种替代物回收率计算衍生化反应效率（图2）。结果表明，替代物回收率随温度升高而增加，温度超过55℃，处理后的液体中已基本没有残余的酚类物质。并且，替代物加标回收率（91%和93%）也满足检测要求，而温度超过60℃萃取液极易沸腾，导致溶剂损失过快。又因为在水浴锅中反应，温度控制较为困难，因此温度设定在55～60℃之间即可，无需过于精确。

2.3.3 衍生化时间的确定

准备7个加标样品进行前处理，并按上述方法进行衍生化反应。从第10min开始浓缩处理，并计算替代物回收率（图3）。结果显示，替代物回收率随时间增加而增加，反应时间超过50min后，两种替代物回收率分别为89%与87%，已经可以满足检测要求，而时间达到60min衍生反应基本完成，处理液中几乎没有残余的酚类物质。因此，衍生化时间确定为60min。

2.3.4 衍生化试剂的用量

图2 不同温度下衍生化的替代物回收率变化Fig.2 Changes in the recovery of substitutes derived at different temperature

图3 衍生化时间对替代物回收率的影响Fig.3 Effect of derivation time on the recovery of substitutes

关于五氟苄基溴与碳酸钾的加入量，主要考虑的是确保曲线最高浓度也能快速、完全反应，以及可适用于高浓度实际样品。而碳酸钾的作用是消耗反应生成物，加速衍生化反应进行，因此需要两种衍生化试剂远远过量即可。通过试验，确定过量10倍左右较为合适。通过计算，将衍生物加入量定为各100μL（五氟苄基溴浓度50mg/mL，碳酸钾浓度100mg/mL）。

2.4 方法检出限、基质加标回收率与精密度

采用ASE处理加标后的空白样品（加标浓度为10μg/kg），重复7次测定并计算酚类化合物的方法检出限，得到的方法检出限为0.67～3.95μg/kg，测定下限为2.68～15.8μg/kg（表4）。五氟苄基溴衍生化产物，相较原酚类化合物增加了大分子量基团，提升了衍生物的稳定性，也提高了质谱响应值，与“全国土壤污染状况详查土壤样品分析测试方法”、杨丽 莉 等［20］、Helaleh等［44］研 究 结 果（10～80 μg/kg）相比显著降低了检出限。

对复垦土地样品进行基质加标回收率实验，三个加标浓度分别为40μg/kg、100μg/kg、200μg/kg。每个浓度样品重复6次，分析结果见表5。可以看出，高浓度回收率范围为73.6% ～103.0%，相对标准偏差（RSD）为2.1%～9.6%；中间浓度回收率范围为73.3%～88.5%，RSD为1.7% ～9.5%；低浓度回收率范围为75.4%～107.0%，RSD为3.7%～6.6%。实验结果表明，ASE提取方法对高、中、低三种浓度的基质加标样品的回收率都在70.0% ～130.0%之间，并且RSD均小于10%，结果满意。

表4 酚类化合物衍生化方法检出限Table 4 Detection limits of phenolic compounds by derivativation method

表5 酚类化合物加标回收率和精密度Table 5 Spiked recovery and precision tests of phenolic compounds

2.5 复垦土地实际样品酚类化合物检测情况

按照优化后的方法对采自陕西某金属矿区复垦土地采集的实际样品进行分析。首先将采集的样品阴干、敲碎、过筛，并收集粒径小于0.425mm的部分。称取5g样品，加入两种替代物使其理论浓度为100μg/kg，拌入5g无水硫酸钠，装入萃取池，用粒装硅藻土填充空隙。按照ASE萃取条件进行提取。提取液浓缩后用硅酸镁小柱净化，净化后的溶液再次浓缩至3mL左右，丙酮定容至8mL。按照优化后的方法进行衍生化。然后浓缩至1mL以下加入内标物定容至1mL，用气相色谱-质谱仪测定，结果见表6。

表6 金属矿区复垦土地样品酚类化合物检测结果Table 6 Analytical results of phenolic compounds in dreclaimed land samples from metalmining areas

两种替代物回收率分别是102%、90.6%与87.6%、93.7%，重复样品的相对偏差（2.3% ～10%）均小于20%，并且低浓度组分结果稳定，最终测定结果满意，说明该方法适用于复垦土地样品酚类污染物的分析检测。

3 结论

本文针对目前复垦土地（土壤）样品中酚类污染物检测的问题，采用衍生化-气相色谱质谱法进行测定。比对筛选样品提取方法，优化并确定了衍生化试剂与条件等参数，规定了质量控制方法。该方法较之非衍生化方法检出限更低，衍生物色谱响应值提高，各化合物的峰面积（峰高）更均衡。衍生化反应的选择性与质谱的选择离子模式分析，更能避免杂质与其他组分的干扰。实际样品的分析结果表明，该方法更适用于复垦土地以及各类复杂基质土壤与固体废物样品中的痕量酚类污染物检测。

目前衍生化测试方法的应用已较为成熟，操作容易，便于推广，具有广阔的应用前景。关于如何进一步简化衍生化步骤，提高分析效率，甚至寻找更适合的衍生化试剂等方面，还有待进一步研究。