miR-650在溃疡性结肠炎患者血浆中的表达水平及其与预后的关系

何 英 张慧华 吴小明

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性肠道炎性疾病，具有复发率高、预后差的特点[1]。目前UC的发病机制尚未完全阐明，多数学者认为其与基因、免疫功能及外源性物质引发的宿主反应等有关[2]。近年来，中国UC的发病率呈升高趋势[3]。及早了解UC预后情况，对于临床医师制定治疗方案及改善患者预后均有重要意义，然而，目前尚缺乏有效的指标用以评估UC患者的预后情况。微RNA(miRNA)是一种不具备编码蛋白质功能的单链RNA，由18～24个核苷酸组成，多种miRNA已被证实参与了UC发病及进展的过程[4-5]。有报道指出，miR-650可参与神经胶质瘤[6]、甲状腺癌[7]、肝细胞癌[8]、非小细胞肺癌[9]、慢性淋巴细胞性白血病[10]及阿尔茨海默症[11]等的发病及进展过程。此外，近年来有研究报道miR-650可靶向核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6，促进炎性反应诱导的肠上皮细胞凋亡，从而参与UC的发病及进展[12]。本文探究了miR-650与UC患者预后的关系，以期为UC的预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2017年3月至2019年10月在浙江衢化医院就诊的117例UC患者作为研究对象。参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[13]诊断UC。纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)确诊为UC；(3)能够配合完成治疗及相关检查；(4)签署知情同意书。排除标准：(1)合并除UC以外的自身免疫性疾病；(2)就诊前3个月内服用抗炎药物或免疫抑制剂；(3)合并感染性疾病，如急性胃肠炎；(4)严重肝、肾功能异常；(5)有UC相关并发症，如结肠大出血、UC相关黏膜异常增生等；(6)合并恶性肿瘤；(7)合并类风湿关节炎、心力衰竭等。117例UC患者中男性58例，女性59例，年龄24～45岁，平均年龄为(37.42±4.26)岁。本研究经浙江衢化医院医学伦理委员会批准。

1.2 信息收集

收集所有受试者的年龄、性别、病变范围、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6及UC内镜下严重度指数(UCEIS)等信息。使用ALIFAX Test 1型全自动快速血沉分析仪(购自意大利ALIFAX公司)检测ESR，采用酶联免疫吸附测定法检测CRP、IL-1β和IL-6的表达水平。根据受累肠段最严重处的血管纹理、出血情况、糜烂和溃疡程度计算UCEIS。血管纹理：血管纹理正常记0分，血管斑片状记1分，血管完全闭塞记2分；出血情况：黏膜和肠腔无出血记0分，黏膜和肠腔轻度出血记1分，黏膜和肠腔中度出血记2分，黏膜和肠腔重度出血记3分；糜烂和溃疡程度：无糜烂和溃疡记0分，糜烂记1分，浅表性糜烂和溃疡记2分，深部糜烂和溃疡记3分。以上3项评分之和为UCEIS评分[14]。

1.3 治疗方案

参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[13]治疗UC，治疗方案主要包括纠正水、电解质紊乱，贫血及低蛋白血症等；对于轻、中度UC患者给予5-氨基水杨酸(5-ASA)治疗；对于5-ASA疗效不佳的中、重度UC患者给予糖皮质激素或英夫利昔单抗治疗；对于频繁复发及激素依赖的UC患者加用免疫抑制剂治疗。

1.4 预后评估

采用复诊方式了解UC患者的预后。患者于治疗后3个月行结直肠镜检查，以评估预后情况。本研究将治疗后3个月时愈合欠佳(黏膜血管纹理不清，伴有水肿、充血、糜烂或溃疡等)、复发(黏膜愈合后再次出现UC相关症状，如肠黏膜血管纹理不清、出血、糜烂或溃疡等)、并发结肠大出血、中毒性巨结肠、UC相关黏膜异常增生、癌变及接受肠切除手术治疗定义为预后不良。

1.5 血浆miR-650表达水平检测

实时荧光定量聚合酶链反应(real-time qPCR)法检测UC患者血浆miR-650的表达水平[15]。具体步骤：在治疗前及治疗后(用药2周)分别抽取UC患者肘部静脉血10 mL，4 000 r/min离心10 min，提取上层清液；使用总RNA提取试剂盒提取总RNA，然后取2 μg总RNA至反转录试剂盒中，反应生成cDNA；最后使用PCR仪进行扩增反应，反应条件为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共计35个循环。内参为U6。ΔCt=CtmiR-650-CtU6，采用2-ΔΔCt表示miR-650的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 UC患者的预后情况

117例UC患者中有44例(37.61%)预后不良，其中18例(15.38%)黏膜愈合欠佳，22例(18.80%)复发，1例(0.85%)并发结肠大出血，3例(2.56%)接受肠切除手术治疗。

2.2 预后良好组和预后不良组的基本资料比较

根据UC患者的预后情况将其分为预后良好组(n=73)和预后不良组(n=44)。两组在年龄、性别、IL-1β、IL-6、ESR和病变范围方面比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。与预后良好组相比，预后不良组CRP、UCEIS评分及应用糖皮质激素的比例均较高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

2.3 预后良好组和预后不良组血浆miR-650表达水平比较

117例UC患者中初始治疗方案采用5-ASA的有44例，38例采用糖皮质激素，4例采用英夫利昔单抗，31例采用糖皮质激素+免疫抑制剂。接受上述4种方案治疗后的血浆miR-650表达水平分别为0.50±0.16、0.57±0.18、0.43±0.10和0.58±0.16，差异无统计学意义(F=2.192，P=0.093)。

预后良好组和预后不良组治疗前血浆miR-650表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。两组治疗后血浆miR-650表达水平均较治疗前降低，且预后良好组血浆miR-650表达水平低于预后不良组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 两组的基本资料比较

表3 两组血浆miR-650表达水平比较

2.4 血浆miR-650诊断UC预后的效能

治疗前miR-650诊断UC预后的ROC曲线下面积(AUC)、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.529(95%CI：0.435～0.622)、1.14、50.00%和61.64%。治疗后miR-650诊断UC预后的AUC、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.865(95%CI：0.790～0.921)、0.58、88.64%和82.19%。结果显示，治疗后miR-650诊断UC预后的效能高于治疗前miR-650，差异有统计学意义(Z=5.117，P<0.001)。见图1。

2.5 影响UC患者预后的因素

将可能与UC患者预后有关的因素如CRP、UCEIS评分、初始治疗方案(应用糖皮质激素)和血浆miR-650(治疗后)作为自变量，将UC患者的预后情况作为因变量，纳入多因素Logistic回归分析模型，结果显示UCEIS评分、初始治疗方案和血浆miR-650均是UC预后的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

图1 血浆miR-650诊断UC预后的ROC曲线

表4 影响UC患者预后的Logistic回归分析

2.6 血浆miR-650与UC预后的关系

采用限制性立方样条拟合Logistic回归模型分析血浆miR-650与UC预后的关系，当节点个数为5时，AIC值最小，AIC=102.698。分析结果显示miR-650表达水平与UC预后有关(χ2=37.33，P<0.001)，且呈非线性关系(χ2=10.98，P=0.012)。以治疗后miR-650评估UC预后的最佳截断值作为参考，即与miR-650=0.58时比较，当miR-650<0.58时，患者发生预后不良风险降低；当miR-650>0.58时，患者发生预后不良风险升高。见图2。

图2 血浆miR-650与UC预后关系的限制性立方样条图

3 讨论

肠上皮细胞在机体免疫防御方面发挥着重要作用，可阻止外源性物质进入机体。有研究报道，miR-650在细胞凋亡过程中起着关键作用[16]。另有研究表明，miR-650可诱发肠上皮细胞凋亡，促使UC发病及进展[12]。由此推测，miR-650表达水平可能与UC的预后有关。本研究结果显示，治疗后预后良好组和预后不良组血浆miR-650表达水平均较治疗前降低，且预后良好组血浆miR-650表达水平低于预后不良组，提示miR-650参与了UC的进展过程，检测其水平或可评估UC预后。

本研究采用结直肠镜检查了解UC患者的预后情况，结果显示UC患者的预后不良发生率为37.61%，与刘会永等[17]的研究结果相近。本研究构建了miR-650诊断UC预后的ROC曲线，结果显示治疗后miR-650评估UC预后的AUC、敏感度和特异度分别为0.865、88.64%和82.19%，其效能高于治疗前miR-650，提示治疗后miR-650对于UC预后评估具有较高价值，可辅助指导临床医师制定UC治疗方案及评估预后。

既往研究结果显示，UCEIS评分和激素疗法是UC预后的危险因素[18-20]。本研究采用Logistic回归模型分析影响UC患者预后的相关因素，结果显示UCEIS评分、初始治疗方案是UC预后的独立危险因素，与上述研究结果一致。本研究结果还显示血浆miR-650亦是UC预后的独立危险因素。此外，限制性立方样条拟合Logistic回归分析结果显示血浆miR-650表达水平与UC预后有关，与miR-650=0.58时比较，当miR-650<0.58时，患者发生预后不良的风险降低；当miR-650>0.58时，患者发生预后不良的风险升高。上述结果均表明血浆miR-650与UC患者预后有关，推测其原因为miR-650可调控UC患者肠上皮细胞凋亡，检测其表达水平有助于了解细胞凋亡情况，进而可反映患者的预后情况。

综上所述，血浆miR-650表达水平与UC患者的预后密切相关。治疗后血浆miR-650表达水平越高，提示UC患者预后不良的风险越高。检测UC患者血浆miR-650表达水平有助于评估患者预后。本研究仍存在一定不足，如纳入研究的样本量偏小，且为单中心研究，导致结果可能存在偏倚，下一步将开展大样本、多中心研究。此外，本研究仅检测了治疗2周后的miR-650表达水平，尚不能确定其是评估预后的最佳时点，下一步将增加检测时点，以弥补本研究的不足。