维吾尔族与汉族痤疮患者皮肤微生物分布特点分析

黄桃源 帕力旦·阿布都卡的 买买提斯依提·买买提斯依明 马新莉 唐三梅 肖树朋 何仁亮

痤疮是毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病， 多发生于面颊部、 胸部等皮脂溢出区［1］， 临床表现为粉刺、 丘疹、 脓疱、 结节等， 对患者身心健康均具有较大影响。 已有研究表明， 皮肤表面寄居的数以亿计的微生物可参与机体抵御外界病原菌的入侵， 激活机体先天性和适应性免疫反应［2］， 然而， 一旦发生菌群失衡即可引发痤疮等炎症性皮肤病。 如寄生于毛囊皮脂腺中的痤疮丙酸杆菌可通过诱导炎症因子的释放而引发痤疮的发生［3－4］； 表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌等可通过诱导人外周血单核细胞分泌肿瘤坏死因子⁃α （tumor necrosis factor alpha，TNF⁃α）、 白细胞介素 （interleukin， IL） ⁃1、 IL⁃6而引发毛囊皮脂腺的炎症反应［5］。 部分研究学者指出， 不同民族人群由于生活环境、 生活习惯不同可造成皮肤微生物菌群分布差异， 但是否会导致引发痤疮的微生物分布及治疗敏感性不同却未见报道。鉴于此， 笔者于本研究中分析了维吾尔族和汉族痤疮患者的皮肤微生物分布特点， 以期为后续的临床精准治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料

分别选取2018 年6 月喀什地区第一人民医院收治的5 例维吾尔族痤疮患者和南方医科大学皮肤病医院收治的5 例汉族痤疮患者作为研究对象， 两族患者性别、 年龄、 体重及痤疮严重程度均无明显差异（P均＞0.05）， 具有可比性， 详见表1。

表1 维吾尔族和汉族痤疮患者临床资料对比Table 1 Comparison of clinical data of Uyghur and Han patients with acne

1.2 主要试剂与仪器

TransGen AP221⁃02 聚合酶： 北京全式金生物技术有限公司生产； AxyPrep RNA 凝胶回收试剂盒： 美国Axygen 公司生产； QuantiFluorTM⁃ST 蓝色荧光定量系统： 美国Promega 公司生产； TruSeqTMRNA Sample Prep Kit 试剂： 四川瑞博特生物科技有限公司生产； 甲醇、 乙腈、 乙醇（均为色谱纯）：德国Merck 公司生产； PCR 仪： 美国ABI 公司生产； Illumina MiSeq 测序仪： 美国Illumia 公司生产。

1.3 样品收集

皮肤采样区于70% 乙醇消毒后， 用生理盐水＋0.1%吐温⁃20 溶液润湿的无菌棉棒反复旋转擦拭25 s 后， 将棉棒放入采集管内， 置入－80 ℃环境中保存备用。

1.4 微生物16S rRNA 多样性检测

收集样品中加入裂解液70 ℃孵育5 min， 洗涤液除去杂质后， 将样品置入吸附柱， 洗脱液洗脱提取总DNA， 并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量；按指定测序区域合成带有条形码（barcode） 的特异引物27F_338R （F 端序列为AGAGTTTGATCCTG GCTCAG， R 端序列为TGCTGCCTCCCGTAGGAGT），并在95 ℃变性7 min、 95 ℃变性10 s、 52 ℃退火1 min、 72 ℃延伸2 min （重复30 个循环） 的条件下进行PCR 扩增， 扩增产物使用AxyPrep RNA 凝胶回收试剂盒回收， 采用QuantiFluorTM⁃ST 蓝色荧光定量系统进行定量检测； 构建Miseq 文库， 并将Illumina 官方接头序列添加至目标区域外端后， 再次使用AxyPrep RNA 凝胶回收试剂盒进行回收； 继而加入改造后的DNA 聚合酶及带有4 种荧光标记的dNTP， 读取模板序列第一轮聚合反应核苷酸种类， 化学切割荧光基团及终止基团， 恢复3’端粘性（循环操作至每条模板序列都完全被聚合为双链）；统计每轮聚合反应收集的荧光信号结果， 获知模板DNA 片段序列。

1.5 统计学处理

采用Flash 软件对Illumina MiSeq 检测的数据进行优化及过滤后， 使用Qiime 平台进行OUT 聚类、物种分类、 多样性指数分析以及测序深度检测。 最终所得数据于SPSS 23.0 统计软件中进行正态分布检验、 方差齐性检验以及计数资料的卡方检验与计量资料的t检验， 物种及代谢物的相关性分析采用Spearman 相关性分析， 均以P＜0.05 为差异具有统计学意义； 热图绘制采用Complex Heatmap 软件，相关性热图绘制采用psych 与pheatmap 软件， β 多样性分析采用reshape 2、 ggplot 2、 factoextra 软件。

2 结果

2.1 微生物α 多样性分析

维吾尔族患者面部皮肤微生物α 多样性Chao指数中位数为614、 Simpson 指数为0.0194， 汉族患者面部皮肤微生物α 多样性Chao 指数中位数为662、 Simpson 指数为0.0226， 维吾尔族痤疮患者面部皮肤微生物丰富度和多样性均显著低于汉族痤疮患者（P均＜0.05）， 见图1。

2.2 微生物β 多样性分析

维吾尔族患者面部皮肤微生物主要为奈瑟菌属（neisseria）、 微 球 菌 （ micrococcus）、 链 球 菌（streprococcus）， 汉族患者面部皮肤微生物主要为劳特罗普氏菌（lautropia）、 鲍曼不动杆菌（acine⁃tobacter baumannii）、 痤疮丙酸杆菌（propionibacte⁃rium acnes）。 主坐标分析（PCoA） 结果显示， 维吾尔族和汉族痤疮患者面部皮肤微生物β 多样性存在显著差异（P＜0.05）， 见图2。

2.3 微生物OUT 分类分析

热图分析结果显示， 维吾尔族患者面部皮肤微生物中丰富度较高（红色代表丰富度较高， 紫色代表丰富度较低） 的有奈瑟菌属、 微球菌、 链球菌，汉族患者面部皮肤微生物中丰富度较高的有劳特罗普氏菌、 鲍曼不动杆菌、 痤疮丙酸杆菌， 维吾尔族和汉族痤疮患者面部皮肤微生物种类存在显著差异（P＜0.05）， 见图3。

2.4 微生物OUT 分类与痤疮相关性分析

Spearman 相关性分析结果显示， 维吾尔族和汉族患者痤疮的发生均与痤疮丙酸杆菌具有显著相关性（r＝0.751、 0.583，P均＜0.001）， 见图4。

图1 维吾尔族和汉族痤疮患者面部皮肤微生物α 多样性Chao 指数（A） 及Simpson 指数（B） 柱状图Fig.1 Bar graphs of Chao index （A） and Simpson index （B） of facial skin microbe α diversity in Uyghur and Han patients with acne

3 讨论

皮肤作为人体最大的器官， 其表面定植有数以亿计的微生物， 且这些微生物可通过调节机体先天性免疫和适应性免疫影响皮肤健康［6］， 如皮肤微生物的失衡可导致痤疮等皮肤问题的发生。 且临床研究证实， 不同民族人群由于生活环境和饮食习惯不同， 皮肤微生物的组成亦不相同。 鉴于此， 本研究笔者为探寻不同民族痤疮患者皮肤微生物分布情况， 以便为不同患者提供个性化治疗方案， 利用16S rRNA 测序分析了维吾尔族和汉族痤疮患者面部皮肤微生物的多样性、 OUT 分类及其OUT 分类与痤疮的相关性。

图2 维吾尔族和汉族痤疮患者面部皮肤微生物β 多样性分析主要贡献图Fig.2 Major contribution chart of facial skin microbe β diversity in Uyghur and Han patients with acne

图3 维吾尔族和汉族痤疮患者面部皮肤微生物OUT 分类组成热图Fig.3 OUT classification heatmap of facial skin microbes in Uyghur and Han patients with acne

图4 维吾尔族和汉族痤疮患者面部皮肤微生物OUT 分类与痤疮相关性分析（A 为汉族、 B 为维吾尔族）Fig.4 Correlation analysis between facial skin microbe OUT classification and acne in Uyghur and Han patients with acne （A： Han nationality； B： Uyghur nationality）

相关研究证实， 痤疮的发生与皮肤微生物构成的微生物环境密切相关， 不同患者皮肤微生物的差异可导致患者愈后效果各不相同。 而本研究结果显示， 维吾尔族和汉族痤疮患者面部皮肤微生物的多样性存在显著差异， 但患者痤疮的发生均与痤疮丙酸杆菌具有显著相关性。 可能与Contassot E 等［7－9］研究显示的痤疮丙酸杆菌能够引起IL⁃1α、 IL⁃1β、Toll 样受体（toll⁃like receptor， TLR） ⁃2、 TLR⁃4 等过度释放而导致的毛囊漏斗部过度角化有关。 另外， 也有研究表明， 链球菌可通过诱导人外周血单核细胞释放IL⁃1β、 TNF⁃α、 IL⁃6 等多种炎症因子引发炎症反应而诱发痤疮的发生［10］。 且链球菌还能通过激活TLR⁃2 及酯酶破坏毛囊壁加重炎症反应， 并形成生物膜抵御抗生素的杀菌作用［8］。 而本研究结果显示， 维吾尔族患者痤疮的发生与链球菌高度相关， 但汉族患者痤疮的发生与链球菌的相关性却不高。 这可能就是导致不同患者同种治疗方式效果不一样的原因之一， 有待进一步深入研究探讨。

综上所述， 维吾尔族和汉族痤疮患者面部皮肤微生物的多样性、 OUT 分类均存在显著差异， 但痤疮的发生均与痤疮丙酸杆菌具有显著相关性， 其是否会对痤疮的治疗效果产生影响还需进一步深入研究探讨。