基于网络药理学和分子对接分析补肾活血颗粒治疗帕金森病分子机制

王 鹏，王 亮，侯晓圆，潘 宇，李绍旦，杨明会

(中国人民解放军总医院中医医学部,北京 100048)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种好发于中老年人群的中枢神经退行性疾病，主要有静止性震颤、姿势平衡障碍、肌僵直、抑郁、失眠等运动性和非运动性症状[1-2],并以黑质多巴胺能神经元进行性退变、路易小体形成为病理特征。流行病学调查显示，我国65岁以上人群PD发病率为1 700/10万，面对我国老龄化日益加重的趋势，进一步推动PD的治疗研究与防控势在必行[2]。

补肾活血颗粒是解放军总医院中医医学部杨明会主任根据多年临床经验与疗效反馈所创制，其组成为赤芍、川芎、当归、丹参、肉苁蓉、山茱萸、石菖蒲、蜈蚣、水蛭。补肾活血颗粒经前期临床研究，发现该方疗效稳定，能够升高PD患者脑内多巴胺水平，降低PD患者静息状态下的肌张力，缓解肌僵直症状，同时改善患者睡眠，提高生活质量[3-6]。网络药理学由Hopkins于2007年提出，借助于网络分析的方法，通过“多成分、多靶点、多途径”研究药物与疾病靶点之间的关系，网络药理学认为疾病发生的本质是网络某个或多个节点所代表的基因或者其编码的蛋白处于失衡状态[7-8]。这与中医对疾病的发生发展规律不谋而合，中医认为疾病的本质是人体阴阳属性出现偏差，并通过中药复方多角度、多途径纠正偏差。本文以网络药理学为研究方法，分析补肾活血颗粒调控PD的分子机制，从“疾病-基因-通路”多维度揭示PD发病规律与药物作用途径，有助于丰富中药复方补肾活血颗粒科学内涵，探索研究新的药物，推动中医药的传承与发展。

1 材料与方法

1.1 补肾活血颗粒靶点查找与筛选借助于中药系统药理数据库及分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[9]查找补肾活血颗粒各组分的活性成分和作用靶点，并以口服利用度(oral bioavailability，OB)>30%、类药性(drug-likeness，DL)>0.18为条件对查询到的中药成分进行ADME属性值筛选。将筛选得到的活性成分与数据库中的靶点一一对应，并通过uniprot数据库(https://www.uniprot.org)，将得到的靶标进行注释。

1.2 查询PD相关疾病靶点在GeneCards疾病数据库中(https://www.genecards.org/)搜索关键词“Parkinson disease”，查找疾病靶基因，将检索到的靶基因根据相关度值中位数进行筛选，删除小于中位数值的靶标。

1.3 构建补肾活血颗粒-PD靶点PPI网络通过R语言，对取得的药物靶点与疾病靶点取交集，得到疾病-药物共同作用靶点集合，并绘制韦恩图。将得到的疾病-药物共同靶点基因输入到STRING11.0(https://string-db.org)数据库，构建补肾活血颗粒-PD靶点PPI网络[10]，设置生物类别为“Homo Sapiens”、“interaction score”设为“highest confidence>0.9”，其余设置均为系统默认值。下载“string.tsv”文件，使用Cytoscape 3.7.1对PPI网络文件进行编辑，并使用插件MCODE分析该网络图中潜在蛋白质功能模块。

1.4 补肾活血颗粒-PD靶点功能与通路的富集分析利用Metascape在线基因注释平台(https://metascape.org/gp/index.html)对疾病和药物共同作用的靶点进行功能富集分析，导入数据后，将P值设为<0.01，将获得的结果保存后，运用office2016 Excel工具将获得的结果进行可视化。

1.5 构建补肾活血颗粒-PD靶点-作用通路网络图利用Cytoscape 3.7.1将得到的药物-疾病共同作用靶点、活性成分和KEGG信号通路构建补肾活血颗粒-PD靶点-作用通路网络图。借助软件内置的计算工具，计算网络节点特征值参数，将结果导出，根据度(degree)、介度(betweenness)和紧密度(closeness)筛选活性成分及蛋白质靶点，为分子对接作准备。

1.6 分子对接通过Cytoscape 3.7.1计算网络节点特征值，筛选活性成分和蛋白质，通过PROTEIN DATA BANK、ZINC(http://zinc.docking.org)查找受体蛋白、配体小分子，并下载其3D结构，借助于AUTODOCK和PYMOL软件进行分子对接和可视化操作。

2 结果

2.1 获得补肾活血颗粒作用靶点通过TCMSP查询补肾活血颗粒的化学成分，经过ADME筛选之后，其所含化学成分数量如下：赤芍29个，川芎7个，丹参65个，当归2个，肉苁蓉6个，山茱萸20个，石菖蒲4个，蜈蚣等为动物类药，数据库中尚未收录。同时根据uniprot数据库查询到的蛋白质，对补肾活血颗粒药物作用靶点进行注释，筛去uniprot数据库中不包含的作用靶点，获得的各中药靶点数目如下：赤芍121个，川芎31个，丹参666个，当归50个，肉苁蓉171个，山茱萸93个，石菖蒲75个，合并上述靶点删去重复值共有靶点201个。

2.2 获取PD疾病靶点通过Genecards数据库共检索到与PD相关的疾病靶点7 654个，计算“relevance score”中位数值为3.31，选择分值大于中位数的靶点，最终得到靶点3 825个。

2.3 构建补肾活血颗粒-PD靶点PPI网络通过R语言程序，取交集，并制作生成补肾活血颗粒-PD作用靶点韦恩图，共得到共同靶点145个，见Fig 1。根据中药-疾病共有的靶标逆向筛选中药复方活性成分，删除重复项共获得活性成分81个，见Tab 1。将获得的共同靶点通过STRING11.0平台，制作PPI蛋白质-蛋白质互作网络图，将获得的蛋白互作网络图导入至cytoscape 3.7.1中，并利用MCODE分析其潜在蛋白质功能模块。补肾活血颗粒-帕金森病靶点PPI网络中的module，见Fig 2。

Fig 1 Venn diagram of components of Bushen Huoxue granules-PD target

2.4 基因本体与作用通路富集分析通过Metascape在线基因注释平台，对获得的药物-疾病共同作用靶点进行功能和作用通路的富集分析。根据LogP值升序排列，取其前20位。由富集结果可以看出，补肾活血颗粒作用的靶点与PD的发病机制有密切的联系。其中，补肾活血颗粒主要参与的生物学过程包括：对有毒物质的反应(response to toxic substance)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对细菌起源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)、对无机物的反应(response to inorganic substance)、细胞因子介导的信号通路(cytokine-mediated signaling pathway)，见Fig 3A。参与的主要通路包括PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、内分泌抵抗等，见Tab 2和Fig 3D。

Tab 1 Main components of Bushen Huoxue granules

DrugCodingMOLIDActiveingredientOB(%)DLDS34MOL007108Isocryptotanshi-none54.980.39DS35MOL007111IsotanshinoneII49.920.4DS36MOL007119MiltiononeⅠ49.680.32DS37MOL007120MiltiononeⅡ71.030.44DS38MOL007121Miltipolone36.560.37DS39MOL007122Miltirone38.760.25DS40MOL007124Neocryptotanshinoneii39.460.23DS41MOL007125Neocryptotanshinone52.490.32DS42MOL0071271-methyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[5,6-g]benzofuran-6,10,11-trione34.720.37DS43MOL007130Prolithospermicacid64.370.31DS44MOL007132(2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionicacid109.380.35DS45MOL007141Salvianolicacidg45.560.61DS46MOL007142Salvianolicacidj43.380.72DS47MOL007143SalvilenoneⅠ32.430.23DS48MOL007145Salviolone31.720.24DS49MOL007150(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-quinone75.390.46DS50MOL007151TanshindiolB42.670.45DS51MOL007152PrzewaquinoneE42.850.45DS52MOL007154Tanshinoneiia49.890.4DS53MOL007155(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-dione65.260.45DS54MOL007156TanshinoneⅥ45.640.3DGDG1MOL000358Beta-sitosterol36.910.75DG2MOL000449Stigmasterol43.830.76RCRRCR1MOL000098Quercetin46.430.28RCR2MOL000358Beta-sitosterol36.910.75RCR3MOL005320Arachidonate45.570.2RCR4MOL005384Suchilactone57.520.56RCR5MOL007563Yangambin57.530.81RCR6MOL008871Marckine37.050.69SZYSZY1MOL000358Beta-sitosterol36.910.75SZY2MOL000449Stigmasterol43.830.76SZY3MOL001494Mandenol420.19SZY4MOL001495Ethyllinolenate46.10.2SZY5MOL002879Diop43.590.39SZY6MOL0054812,6,10,14,18-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaene33.40.24SZY7MOL005503Cornudentanone39.660.33SZY8MOL005530Hydroxygenkwanin36.470.27SZY9MOL008457Tetrahydroalstonine32.420.81SCPSCP1MOL000422kaempferol41.880.24SCP2MOL0035428-Isopentenyl-kaempferol38.040.39SCP3MOL003576(1R,3aS,4R,6aS)-1,4-bis(3,4-dime-thoxyphenyl)-1,3,3a,4,6,6a-hexahydro-furo[4,3-c]furan52.350.62注：CS:赤芍，DS:丹参，DG:当归，RCR:肉苁蓉，SZY:山茱萸，SCP:石菖蒲

Fig 2 Module of Bushen Huoxue granules-PD target PPI network

Fig 3 Enrichment analysis of potential targets of main components of Bushen Huoxue granulesNotes:A：GO-BP；B:GO-CC；C：GO-MF；D:KEGG

Tab 2 Enrichment results of Bushen Huoxue granules treatment of PD target pathway

补肾活血颗粒靶点治疗PD的功能主要富集于蛋白激酶结合(protein kinase binding)、激酶结合(kinase binding)、蛋白质同聚活性(protein homodimerization activity)、转录因子结合(transcription factor binding)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)，见Fig 3C。

Fig 4 Schematic diagram of molecular docking of interaction between quercetin and PTGS2 (1PXX)

2.5 构建补肾活血颗粒-PD靶点-作用通路网络图利用Cytoscape 3.7.1构建“补肾活血颗粒-PD靶点-通路网络图”。使用Cytoscape 3.7.1内置分析功能——Network analyzer分析Fig 5网络节点特征参数值，确定核心成分与核心靶点，并以连接度值的大小取其前5位，见Tab 3。

Tab 3 Network node characteristic parameters of main active ingredients of Bushen Huoxue granules

由Tab 3网络节点特征值参数可知，槲皮素连接度为98、介度为0.33、紧密度为0.55，是补肾活血颗粒主要活性成分，其他活性成分有木犀草素(连接度为43、介度为0.07、紧密度为0.44)、山柰酚(连接度为36、介度为0.05、紧密度为0.41)、丹参酮(连接度为27、介度为0.04、紧密度为0.41)。

PTGS2连接度为77、介度为0.24、紧密度为0.54，是补肾活血颗粒作用的主要靶点，此外，PTGS1(连接度为45、介度为0.07、紧密度为0.47)、SCN5A(连接度为44、介度为0.04、紧密度为0.45)、ADRB2(连接度为41、介度为0.03、紧密度为0.45)、CHRM1(连接度为、介度为0.02、紧密度为0.39)亦是补肾活血颗粒作用的重要靶点，详见Tab 4。

Tab 4 Characteristic parameters of network nodes of main active ingredients of Bushen Huoxue granules

2.6 分子对接通过得到的网络节点特征参数，发现槲皮素连接度最高(连接度为98)是补肾活血颗粒主要活血性成分，PTGS2为主要作用靶点(连接度为77)，因此以槲皮素作为配体小分子，PTGS2为受体蛋白进行分子对接。借助于PROTEIN DATA BANK查找受体蛋白的编码为1PXX，下载其3 d结构，见Fig 4A；并借由ZINC(http://zinc.docking.org)查找配体小分子槲皮素，下载其3 d结构，见Fig 4B。使用AUTODOCK软件对受体蛋白和配体小分子进行分子对接，导出其对接文件，运用pymol将对接结果可视化，得到分子对接模式图，见Fig 4C。从对接结果和分子模式图中，可以发现槲皮素可以结合于1PXX蛋白质，主要通过GLU-67、GLN-54两个氨基酸残基与槲皮素发生H键作用，氢键的结合能为-2.49。

3 讨论

PD又称震颤麻痹症，中医学虽无此病名，却有“颤证”、“震颤”诸症状为病名载之。古代医家认为该病属本虚标实之证，以肝肾阴虚、气血衰弱为发病机制，临床以风邪盛实之状为特点，诚如孙一奎于《赤水玄珠·颤振门》中记载:“颤振者，人病手足摇动，如抖擞之状，筋脉约束不住，而莫能任持，风之象也。”杨明会教授在继承前人发病观的基础上，认为肾虚血瘀亦是颤证发生的关键，皆因肾乃水脏，木水互滋相生，肾虚则精亏水少，充养不足，引动肝风，久之化火生痰，阻滞经络血脉，瘀滞之象从生。补肾活血颗粒方以丹参、山茱萸、肉苁蓉为君药，填精温阳、通行血脉；当归、川芎、赤芍为臣药，活血祛瘀；石菖蒲为佐药，开隧窍逐瘀、除神志迷塞；水蛭、蜈蚣通行经脉，为使药。全方通补兼施，益肾活血并进，共奏补肾活血、益精填髓、通行血脉之功。

本研究发现，补肾活血颗粒治疗PD的主要靶点有PTGS2、PTGS1、SCN5A、ADRB2和CHRM1等。PTGS2，是多表达于中枢神经系统的重要炎性介质，PTGS1亦炎症反应介质之一，PTGS2水平的高表达与神经元损伤、认知障碍具有一定的联系[11]；ADRB2能够与细胞膜上的离子通道受体形成复合物，从而调控离子通道，这与PD发病机制中线粒体功能障碍发病机制有一定联系[12];CHRM1可与乙酰胆碱进行结合，能够保护乙酰胆碱神经元，从而能够影响人体的睡眠、记忆和感觉运动等功能，而PD非运动症状中伴随有失眠、健忘等[13]。通路富集结果中如PI3K/AKT信号通路可影响神经元的发育，并能影响大脑黑质多巴胺的含量[14]；Toll样受体信号通路中的TLR4是重要的免疫炎症受体，参与到神经细胞损伤和破坏血脑屏障等发病机制进程中[15]。

通过PPI网络节点特征值参数，发现主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹参酮等。研究表明，槲皮素能够调节IKKα/NF-κB信号通路，具有抑制神经炎症反应的作用[16]；木犀草素可减少α突触核蛋白聚集水平，降低活性氧(ROS)的水平，同时还能抑制神经炎性反应，减轻神经细胞凋亡，保护神经功能；山柰酚可保护神经元免受β淀粉样蛋白的损伤；丹参酮具有抗炎、抗氧化和保护神经元的作用，对PD的治疗有一定价值，还可减轻细胞凋亡和保护线粒体膜的稳定性[17-18]。

综上所述，本研究通过网络药理学从分子层面进行研究，发现补肾活血颗粒有不同的活性成分，能够参与到不同的生物学进程中去，从多层次、多环节发挥其对PD的作用机制，为临床治疗PD提供了新思路与新参考，同时为后续进一步实验验证补肾活血颗粒作用机制奠定了基础。