转Cry1Ab-t基因玉米YA108的获得及其抗虫性鉴定

岳润清，刘 璐，铁双贵，徐心志，陈娜娜

(河南省农业科学院 粮食作物研究所，河南 郑州 450002)

玉米是我国种植面积最大的粮食作物，不仅是重要的粮食来源，而且还是重要的饲料和工业原料，在我国国民经济中具有举足轻重的地位[1-2]。玉米从播种到收获过程中会发生各种虫害，如亚洲玉米螟、黏虫和地老虎等。在诸多害虫中，亚洲玉米螟和欧洲玉米螟对玉米的破坏最强[3]。通常情况下，会造成春玉米减产10%以上，夏玉米减产严重时达到30%以上，甚至绝收[4]；另外，害虫在咬食玉米后，可造成玉米籽粒缺损、霉粒，玉米品质严重下降[5-6]，对我国玉米生产及养殖业造成巨大的经济损失，培育抗虫玉米是解决该问题的重要手段[7]。

转基因技术为控制玉米害虫提供了新的途径[8]。国外转Bt基因抗虫玉米研究起步早[9]，转基因抗虫玉米于1996年开始商业化种植[10]。相比国外，国内转基因抗虫玉米研究晚，尚未获批商业化种植。目前，国内转基因抗虫玉米的研究主要以能杀死并抑制鳞翅目昆虫生长的Bt基因为主，转Bt基因抗虫玉米不但能有效地防治害虫，而且对环境、有益昆虫及人畜等均无不良影响。在Bt基因中，以Cry1Ab基因应用较多，其编码的杀虫蛋白杀死和抑制亚洲玉米螟效果较好[11-12]。针对Bt基因转入玉米基因组中，存在表达量低、表达的抗虫蛋白不稳定、抗虫效果不理想等问题，生物技术育种课题组对Bt基因Cry1Ab的原始序列进行了改造设计，克隆获得了高效表达的Cry1Ab-Ma基因和杀虫效果增强的Cry1Ab-t蛋白[13-14]，并根据植物基因的密码子偏好性和基因表达蛋白的空间结构对原始抗虫基因Cry1Ab进行优化改造[15]，利用原核表达系统诱导的蛋白进行室内玉米螟喂食试验，获得了具有杀虫效果的Cry1Ab-t基因。本研究在前期研究的基础上将设计改造优化并具有自主知识产权的抗虫基因Cry1Ab-t克隆至带有组成型表达启动子(CaMV 35S启动子)的植物表达载体pCAMBIA33000m中，采用农杆菌介导方法转化玉米幼胚，并采用亚洲玉米螟对转基因玉米进行抗虫性鉴定，为培育优良的抗虫玉米自交系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

转基因受体玉米材料HiII由河南省农业科学院粮食作物研究所提供，取开花后12～14 d的玉米幼胚用于遗传转化。

含有人工改造合成的Cry1Ab-t基因(专利号：ZL 201010552618.0)的重组质粒pCAMBIA3300+35S-Cry1Ab-t、农杆菌菌株EHA105、大肠杆菌DH5α均由河南省农业科学院粮食作物研究所提供。Bt-Cry1Ab/1Ac免疫试纸条(STX 06200/0050)产自于美国Agdia公司。各种限制性内切酶、T4连接酶、DNA聚合酶、反转录试剂盒等均购自TaKaRa公司。其他药品、试剂均为分析纯，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。所用引物均由上海生工有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 农杆菌介导的玉米遗传转化 通过冻融法将重组质粒pCAMBIA3300+35S-Cry1Ab-t导入农杆菌EHA105菌株中，玉米幼胚的遗传转化参照刘允军[16]的方法。将转化后的胚性愈伤组织转移到含1.5 mg/L双丙氨磷的筛选培养基上(D培养基)进行第一轮筛选，然后将筛选到的抗性愈伤组织转移到含3.0 mg/L双丙氨磷的筛选培养基上进行2轮筛选，最后转入分化培养基中进行植株分化再生，待再生苗长至4～5 cm时，移栽至温室。

1.2.2 转基因植株的PCR检测 植物DNA提取按照Saghai-Maroof等[17]的改良后的CTAB方法进行，以转基因玉米和非转基因玉米叶片的全基因组DNA为模板，采用Cry1Ab-t基因特异引物(F:5′-TGACGCTGACTGTGCTCGAT-3′；R:5′-AGGGGGAA CGTGAACTCAGG-3′)和Bar基因特异引物(F:5′-ATGAGCCCAGAACGACGCCCG-3′；R:5′-TCGGTGA CGGGCAGGACCGG-3′)对经过双丙氨磷筛选的T0转基因玉米进行检测。Cry1Ab-t基因预期扩增片段大小为304 bp；抗除草剂Bar基因预期扩增片段大小为552 bp。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.3 转基因植株目的基因的表达 转基因玉米YA108 RNA提取以及RT-PCR检测：待转基因及非转基因玉米生长到5～6叶期，取0.1 g新鲜玉米叶片，液氮充分研磨后利用TRIzol (Invitrogen，美国)提取转基因玉米YA108和非转基因玉米叶片的总RNA，以Oligo(dT) 为引物(北京天根生化科技有限公司)利用反转录试剂盒(Invitrogen，美国)进行cDNA的合成，再以cDNA为模板，扩增Cry1Ab-t、Bar基因和内参基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)GAPDH(F:5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′，R:5′-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3′；扩增片段长度为788 bp)。按照1.2.2基因组DNA的PCR检测方法进行扩增。

转基因材料YA108目的基因特异蛋白的检测：取0.1 g新鲜玉米叶片，液氮充分研磨后，加600 μL缓冲液混匀，将蛋白质检测试纸条按照箭头方向插入检测样品中，静止5 min后观察试纸条。最上面是质控线，下面为目的基因表达蛋白的检测线。

Cry1Ab-t蛋白含量检测：利用美国Agdia公司生产的Bt Cry1Ab/Ac ELISA检测试剂盒检测转基因玉米中Cry1Ab-t蛋白的含量。取转基因材料YA108不同组织样品(叶片、茎、花粉、花丝、苞叶和籽粒)，每个组织取5株，液氮研磨，称量0.1 g磨好的样品加入1 mL样品提取缓冲液。测量过程按说明书进行操作和绘制标准曲线，所有样品的吸光度值均由酶标仪(Biotek Synergy H1)读取。

1.2.4 转基因玉米的抗虫性鉴定 试验所用亚洲玉米螟为河南省农业科学院植物保护研究所提供，植物材料为转基因玉米YA108及非转基因玉米。室内试验采集吐丝期苞叶内部花丝进行饲喂。大田试验采用随机区组设计，待玉米生长到7～8叶期时，以每株40～60头玉米螟初孵幼虫接于新叶上，3 d后重复接虫1次，以非转基因玉米为对照，心叶期接虫14 d后调查食叶级别，采用 9 级标准[18]，并根据食叶级别确定心叶期抗螟性。玉米吐丝期接虫方法同上，接虫部位为花丝。转Cry1Ab-t基因抗虫玉米及非转基因玉米叶片、花丝、茎秆及果穗玉米螟抗性鉴定标准参照农业部953号公告-10.1-2007。

2 结果与分析

2.1 转Cry1Ab-t基因玉米植株的获得

将重组表达载体pCAMBIA3300+35S-Cry1Ab-t转入根癌农杆菌 EHA105，取授粉后的玉米幼穗进行剥胚，采用农杆菌介导的遗传转化方法进行玉米幼胚的转化。共培养后，将愈伤组织转到筛选培养基上，得到抗性愈伤组织，然后将抗性愈伤组织转移至再生培养基，经过分化得到玉米再生植株，再生植株转移至生根培养基，最后进行再生植株的炼苗和移栽(图1-A-F)，共获得116株具有双丙氨磷抗性的T0转基因玉米再生植株。

2.2 转Cry1Ab-t基因玉米植株中外源基因的PCR检测

为了检测再生玉米植株基因组中是否有目的基因Cry1Ab-t和标记基因Bar，依据目的基因Cry1Ab-t和标记基因Bar特异引物进行PCR扩增检测，116株抗性再生植株中有82株可以扩增出与目的基因Cry1Ab-t(304 bp)和标记基因Bar(545 bp)大小一致的目的片段，而非转基因玉米和空白对照没有扩增出特异目标条带，可以初步证明，目的基因Cry1Ab-t已经整合到阳性转基因玉米植株基因组中，部分目的基因Cry1Ab-t和标记基因Bar的PCR检测结果见图2，3。从阳性转基因植株中挑选长势良好、能结实的YA108用于下一步目标基因蛋白表达和抗虫鉴定试验。

2.3 转Cry1Ab-t基因玉米植株中外源基因的表达检测

RT-PCR分析结果表明，在转基因玉米YA108中，目的基因Cry1Ab-t和筛选标记基因Bar在RNA水平上表达稳定，而在非转基因玉米中未检测到表达(图4)。结果证明，外源抗虫基因Cry1Ab-t和筛选标记基因Bar已整合到玉米基因组中并稳定表达。

采用试纸条对转基因玉米YA108进行特异目的蛋白Cry1Ab-t和Bar进行检测，结果表明，转基因玉米YA108 抗虫蛋白Cry1Ab-t和Bar蛋白试纸条均出现质控线和检测线2条带(部分试纸条检测结果见图5)。质控线出现证明结果可信；检测线的深浅与玉米中Cry1Ab-t和Bar蛋白表达的强弱呈正比。从检测结果可以看出，筛选标记蛋白在转基因玉米YA108中得到表达，抗虫目的蛋白Cry1Ab-t在转基因玉米YA108中高效表达。

由图6可知，转基因玉米YA108在所测组织中均能检测到Cry1Ab-t蛋白，叶片中Cry1Ab-t蛋白含量最高，为27.30 μg/g；其次为苞叶，为17.98 μg/g；花丝和茎秆中Cry1Ab-t蛋白含量较低，分别为12.10,12.64 μg/g；Cry1Ab-t蛋白在花粉中含量最低，蛋白含量仅为0.93 μg/g；成熟后水分含量低于15%玉米籽粒中Cry1Ab-t蛋白含量为15.56 μg/g。表明转基因材料YA108各个组织部位均有Cry1Ab-t蛋白表达，可以保证转基因玉米在整个生长期免受靶标害虫危害，提高转基因玉米材料的产量。经多重比较分析发现，茎秆、花丝和雄穗中Cry1Ab-t蛋白含量无显著差异，而根、茎秆、花粉、叶片中Cry1Ab-t蛋白含量差异显著，根、苞叶和种子中Cry1Ab-t蛋白含量无显著差异。

2.4 转Cry1Ab-t基因玉米株系抗虫性鉴定

叶片危害调查结果(图7-A-B)显示，接种亚洲玉米螟后，转基因玉米YA108对靶标害虫玉米螟有很好的控制作用，其植株叶片表面光滑无空洞，食叶级别均为1级，抗性水平为高抗。而相应的非转基因玉米叶片有较多缺刻及虫孔，虫食严重，食叶级别为7级，表现为感虫，YA108叶片危害级别明显低于非转基因玉米。表明转Cry1Ab-t基因玉米材料YA108对亚洲玉米螟有很好的抗性。

室内花丝玉米螟抗虫鉴定结果(图7-C-D)显示，非转基因玉米花丝虫食严重，表现为感虫；而转基因玉米YA108花丝抗虫效果明显，均达到高抗水平，抗虫性表现稳定。

吐丝期将玉米螟幼虫接于玉米花丝，收获时观察玉米茎秆和穗部玉米螟危害程度，结果显示(图7-E-F)，转基因玉米YA108茎秆和穗部受害微小或者不受害，抗性级别为高抗，而非转基因玉米茎秆和穗部受害较严重，属于感虫级别，说明转基因玉米YA108对玉米螟有很强的抗性。

3 结论与讨论

近年来，随着基因工程技术的快速发展，利用转基因技术培育抗虫玉米材料已成为控制玉米螟危害的一种重要手段[19]。王艳辉等[20]通过农杆菌介导的方法将改造合成的Cry1Ab/Ac抗虫基因导入玉米，获得了抗虫效果明显的玉米株系；王悦冰等[2]将经过2次密码子优化的抗虫基因Cry1Ah导入玉米，获得了抗虫蛋白高效表达的转基因株系。国家玉米改良中心赖锦盛课题组[21]通过共转化的方法将改造后的Bt基因转入玉米基因组，获得了抗虫性大幅度提高的优良抗虫转化体。李圣彦等[22]利用密码子优化Btcry1Ah基因，获得了Btcry1Ah基因表达增强的转基因玉米。刘洋等[23]采用农杆菌介导方法获得了转基因材料HiII-NGc-1 ，通过PCR、RT-PCR和试纸条的检测，结合除草剂和玉米螟生测试验，获得了抗虫、抗除草剂双价转基因玉米自交系。常雪等[24]分别将Cry1Ab/Cry2A和Cry1Ab/vip3DA转入玉米自交系中，获得抗虫效果较好的转化体。另外，转Cry1Ab、Cry2Aj基因玉米双抗12-5对黏虫、亚洲玉米螟具有较好的抗性[25]。上述研究结果说明，应用农杆菌介导的方法将优化改造的抗虫基因转化玉米可以得到抗虫性增强的玉米新材料，是一种可行、有效的抗虫玉米育种方法。本研究将前期构建的含有优化改造合成的具有自主知识产权的抗虫基因Cry1Ab-t的植物表达载体导入具有高效转化效率的玉米杂交种HiIIB基因组中，获得了82个转基因玉米植株；采用PCR、RT-PCR、ELISA等方法对转基因材料进行了转基因植株鉴定，成功获得了高抗玉米螟的转Cry1Ab-t基因抗虫玉米材料YA108。

玉米在整个生长季常常遭受多种害虫危害，亚洲玉米螟是我国玉米上的第一大害虫，在全国玉米产区广泛分布。美国孟山都公司研发的第1代转Bt基因玉米Mon810对亚洲玉米螟和欧洲玉米螟具有较高的田间抗虫性[26]。在我国，转Cry1Ab基因玉米对亚洲玉米螟具有较好的田间抗虫效果[27-28]。张爽等[29]对转基因玉米CM8101在心叶期和吐丝期进行田间接虫鉴定，发现转基因玉米CM8101对亚洲玉米螟具有显著的杀虫效果。孙红炜等[30]研究玉米杂交种瑞丰1号对亚洲玉米螟的抗性发现，田间鉴定结果表明，在心叶期接虫瑞丰1号，瑞丰1号对亚洲玉米螟的抗性达到高抗水平。在本研究中，玉米花丝接虫试验表明，非转基因玉米花丝虫食严重，表现为高感玉米螟；而转基因玉米YA108花丝抗虫效果明显，均达到高抗水平，抗虫性表现稳定；吐丝期接虫试验表明，非转基因玉米接虫后期被咬食严重，茎秆多处有蛀孔，伤口处大多有霉菌，而转基因玉米YA108没有受到危害。田间接虫后，无论叶片和花丝，转Cry1Ab-t基因抗虫玉米材料YA108对亚洲玉米螟都具有非常好的抗性，能够短时间杀灭玉米螟幼虫，并极大程度减少了由于虫害引起的霉变。综上，抗虫玉米材料YA108田间抗虫性等级为1级，抗性水平为高抗，本研究为培育优良的抗虫玉米自交系奠定了基础。