1株粘质沙雷氏菌噬菌体的分离和鉴定

肖小平，陈依玲，张仁利

粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)是一种腐生菌，在水和土壤中常见，也经常污染动、植物性食品[1]。粘质沙雷氏菌是一种临床上常见的机会病原菌[2]，医护人员被污染的手被认为是其主要的传播媒介[3-5]。在机体免疫力低下的时候可以引起肺部感染、败血症等疾病[1,6-9]。由于临床上抗生素的滥用和不合理使用，粘质沙雷氏菌对多种抗生素具有耐药，给感染控制和治疗带来挑战[10-11]。除此之外，很多媒介昆虫的幼虫阶段生活在水中，粘质沙雷氏菌在这些昆虫的肠道中也大量存在，促进疾病传播[6,12-14]。噬菌体(Phage)是细菌内寄生生物，在自然界也是分布广泛。噬菌体侵染细菌后可以快速增殖并裂解宿主菌[15]，目前临床上也有用噬菌体用于治疗的尝试[16]。因此分离针对粘质沙雷氏菌的噬菌体对防治粘质沙雷氏菌感染具有潜在的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1主要试剂和仪器 LB营养肉汤(028324，广东环凯微生物科技有限公司)、琼脂(028990，广东环凯微生物科技有限公司)、上层LB培养基(20 g LB营养肉汤加7 g琼脂溶于1L蒸馏水)、下层LB培养基(20 g LB营养肉汤加15 g琼脂溶于1 L蒸馏水)、全温振荡培养箱(Shel lab)、II级A2型生物安全柜(Telstar Bio-II-A)、低温离心机(Eppendorf centrifage 5417R)、单孔水浴锅(JuLBO ED-27)。

1.1.2实验用菌种 粘质沙雷氏菌(Sm01、Baz01、CICC22004、CGMCC1.2818、BNCC107931)、大肠杆菌(TH12641)、金黄色葡萄球菌(780)、绿脓杆菌(Pseudomonassp. SQ-7)均为实验室保存。

1.2噬菌体的分离和培养 取深圳某河边污水，4 000 r/min离心15 min，用0.22 μm的滤膜过滤除菌，将滤液装入无菌培养瓶。取4 mL过滤后的上清，加入200 μL的对数期宿主菌培养液，放置37 ℃，220 r/min培养箱培养3 h，用微孔滤膜过滤得到噬菌体原液。

1.3噬菌体原液单层平板验证实验 准备两块1.5% LB琼脂平板，取宿主菌培养物100 μL滴至平板正中央， 用无菌的涂布棒将菌液均匀地涂开；待其晾干后，取上述噬菌体原液100 μL滴于其中一块板，用无菌的涂布棒将液体均匀地涂开；待自然晾干后，置于37 ℃培养箱培养10 h。

1.4噬菌体双层平板噬菌斑实验 将噬菌体原液10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍比稀释，取相应的几个梯度的噬菌体稀释液各0.1 mL与宿主菌液0.2 mL充分混匀，铺双层琼脂平板， 37 ℃恒温培养10 h左右，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数。根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。在双层琼脂平板上挑取噬菌斑形状大小一致，单个独立的噬菌斑，用无菌的接种针穿刺选好的噬菌斑，接入3 mL LB 肉汤培养基，轻微搅拌几次，加入0.2 mL 含有粘质沙雷氏菌菌液，摇匀之后在室温静置1 h，37 ℃培养12 h, 4 ℃下12 000×g 离心30 min, 用0.22 μm的滤膜过去除菌，上清液4 ℃保存， 获得的单一噬菌体。

1.5噬菌谱实验 选择粘质沙雷氏菌的5个菌株和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌进行实验。准备1.5% LB琼脂平板，每组2块；取100 μL细菌和100 μL噬菌体混合，铺双层琼脂平板，对照组加入等量的PBS，置于37 ℃培养箱培养10 h。

1.6蚊虫肠道内裂解实验 埃及伊蚊(洛克菲勒株)饲养于低温照明培养箱，保持26 ℃～28 ℃恒温、80%湿度，按照文献标准方法进行饲养[17]。选取羽化5～7 d的雌性埃及伊蚊，首先给蚊虫饲喂含有抗生素的10%蔗糖溶液(20 U青霉素、20 mg链霉素/mL)，连续饲喂3 d，每24 h更换。饲喂3 d后将含有抗生素的蔗糖溶液撤走，在温度28 ℃，湿度80%的条件下让其饥饿24 h。然后饲喂带有粘质沙雷氏菌Sm01的蔗糖溶液。连续饲喂3 d。将上述蚊虫分成两组，其中一组只饲喂蔗糖溶液，另外一组饲喂添加了噬菌体SHENZHEN01(107PFU/mL)的蔗糖溶液。18 h后每组挑选4～5只蚊虫进行实验。先用75%的乙醇溶液清洗蚊虫表面3次，无菌PBS清洗1次，接着在体视显微镜下解剖蚊虫的中肠，放入装有400 μL PBS的无菌的EP管中，用无菌的研磨棒进行研磨, 稀释103～105倍涂板，37 ℃培养箱培养12 h。

2 结 果

2.1噬菌体平板验证和单一性筛选实验 在单层平板实验中，涂有菌液的区域长出均匀的粘质沙雷氏菌，涂有加入噬菌体菌液的区域没有菌落出现。由此判断，该噬菌体能够裂解粘质沙雷氏菌，而且噬菌体原液中含有滴度较高的烈性噬菌体(图1A)。单一性噬菌体通过双层平板实验获得，噬菌斑经过多次穿刺培养后，分离得到单一的噬菌体，该噬菌体边缘清晰，噬斑直径约1 mm (培养10 h)(图1B)，我们将该噬菌体命名为SHENZHEN01，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，编号为61140。

A：粘质沙雷氏菌噬菌体单层平板实验；B: 噬菌体单一性筛选。图1 噬菌体噬斑实验Fig.1 Single layer plate plaque formation experiment

2.2噬菌体裂解谱实验 进一步确认SHENZHEN01噬菌体的裂解谱。我们首先选择粘质沙雷氏菌的5个菌株(Sm01、Baz01、CICC22004、CGMCC1.2818、BNCC107931)进行双层平板实验，将噬菌体原液按照1∶1 、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000进行稀释，将噬菌体和粘质沙雷氏菌一起通过双层琼脂平板验证。结果发现SHENZHEN01噬菌体对Sm01和Baz01有明显的裂解能力，对其他3株粘质沙雷氏菌没有裂解作用(图2A)。另外，我们验证了SHENZHEN01噬菌体对其他种类细菌的裂解能力，将噬菌体原液和粘质沙雷氏菌(S.marcescens) Sm01、大肠杆菌(E.coli)TH12641、金黄色葡萄球菌(S.aureus)780、绿脓杆菌(P.aeruginosa)SQ-7一起通过双层琼脂平板验证。结果表明，SHENZHEN01噬菌体不能裂解大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌(图2B)。这些结果表明噬菌体SHENZHEN01的裂解作用有菌株特异性。

2.3蚊虫肠道内裂解实验 蚊虫经过消毒处理，取中肠研磨进行涂板计数。单独饲喂抗生素的蚊子(Mock组)中肠涂在LB 固体平板上几乎不长细菌，表明抗生素处理是成功的；饲喂了粘质沙雷氏菌Sm01的蚊子中肠涂板可见大量细菌生长，表明粘质沙雷氏菌Sm01可以在蚊子中肠成功定植(Serratia marcescens组)；而饲喂了噬菌体SHENZHEN01的蚊子中肠涂板几乎没有细菌生长(Serratia marcescens+phage组)，表明饲喂的噬菌体在蚊子体内也能裂解细菌(图3A), 通过平板计数显示饲喂了噬菌体的蚊子肠子中的粘质沙雷氏菌明显减少(图3B)，充分表明这个噬菌体在蚊虫体内也是有活性的，可以在体内裂解宿主细菌。

A：5株粘质沙雷氏菌与不同稀释度的噬菌体混合涂双层琼脂平板；B：四种细菌分别和噬菌体混合涂双层琼脂平板图2 噬菌体裂解谱实验Fig.2 Bacteriophage lysis spectrum

A: 蚊虫肠道内噬菌体裂解能力；B: 蚊虫饲喂噬菌体后肠道粘质沙雷氏菌计数。Mock组为饲喂含有抗生素的10%蔗糖溶液，3 d后，只饲喂蔗糖溶液；Serratia marcescens组饲喂含有抗生素的10%蔗糖溶液,3 d后，饲喂带有粘质沙雷氏菌Sm01的蔗糖溶液，连续饲喂3 d；Serratia marcescens+phage组为饲喂含有抗生素的10%蔗糖溶液，3 d后，饲喂添加了噬菌体SHENZHEN01(107 PFU/mL)的蔗糖溶液。18 h后每组挑选4～5只蚊虫进行实验。图3 噬菌体在蚊虫肠道内裂解实验Fig.3 Phage lysis in mosquitoes gut

3 讨 论

粘质沙雷氏菌是临床上一种重要的条件致病菌[2]，属于革兰氏阴性菌。在自然界，粘质沙雷氏菌在培养的时候呈现白色、粉红、玫瑰红3种颜色，我们采用的粘质沙雷氏菌来自于蚊虫肠道[14]，呈现白色。粘质沙雷氏菌在临床上可以引起脑膜炎、肺部感染等疾病[6-9]，耐药性的出现使这种菌很容易发生院内感染，对人的健康产生巨大威胁[10-11]。噬菌体不会感染人，只感染特异的细菌，在水产养殖和耐药菌感染治疗方面具有光明的应用前景，越来越多的研究寻找特异性的噬菌体来解决细菌耐药的治疗问题[18]。我们利用埃及伊蚊来源的粘质沙雷氏菌为宿主，从污水中分离得到1株噬菌体SHENZHEN01，通过单层平板实验就可以直接鉴定其裂解能力。由于噬菌体对细菌的裂解能力具有特异性和高效性。我们对噬菌体SHENZHEN01的裂解谱进行了分析，发现SHENZHEN01只对粘质沙雷氏菌Sm01和Baz01有效，对其他3株粘质沙雷氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌均无裂解作用。

粘质沙雷氏菌不仅可以定植到皮肤表面，也可以定植到肠道[2,14,19]。由于动物或者昆虫体内环境与体外环境的差异，只有高效而且能够耐受体内环境的噬菌体才有可能走向应用，目前已经报道的痢疾噬菌体可以在体内应用于相关疾病的治疗[20]。在这里，我们初步研究了噬菌体SHENZHEN01在蚊虫肠道内的裂解效果，结果表明该噬菌体在蚊虫肠道里仍然能够发挥裂解作用，这些研究为后续SHENZHEN01的应用提供重要的基础。

噬菌体由于其感染的特异性，在水产养殖、耐药菌感染、院内特殊病房如烧伤感染等方面具有极大应用价值。噬菌体用于治疗也有本身的缺点，如噬菌谱窄、产生细菌耐药性、给药方式没有统一标准等[21]。寻找更多的噬菌体，应用噬菌体鸡尾酒疗法是一个有效的办法[22]。噬菌体在自然界具有多样性，种类繁多，国家层面也需要加大对噬菌体治疗的基础研究投入，建成全国性甚至世界性的噬菌体库，资源共享，噬菌体治疗的价值才能显现出来。

利益冲突：无