昆虫病原线虫共生菌NK水悬浮剂的研制

廖春丽，杨 溢，袁 源，杜江南，樊星照，桑明博，朱 菁，李冰冰

（1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南平顶山467036；2.河南城建学院河南省水体污染防治与修复重点实验室，河南平顶山467036）

众所周知，化学农药的大量使用，不仅给人类自身的健康带来威胁，而且使很多害虫产生显著的抗药性，许多地方甚至陷入农药越用越多、虫害愈演愈烈的恶性循环。同时，农药残留也导致土壤和水资源污染、农业生物多样性被破坏等一系列的生态、环境和社会问题。因此，寻求新的安全、有效、可持续控制害虫方法——生物防治，成为各国研究的重点。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）对多种害虫具有特异杀虫活性，具有高效、安全及特异性强等特点［1-2］，已广泛应用于农业害虫的防治［3］，而且商业化应用的杀虫蛋白基因也主要来源于Bt。随着Bt菌制剂的大规模应用和表达Bt转基因植物的大面积种植，导致Bt抗性昆虫种群的快速发展。因此，开发新的生物杀虫毒素已成为当务之急［4］。

目前已描述的昆虫病原线虫共生菌分为三个属：致病杆菌属（Xenorhabdus）、发光杆菌属（Photorhabdus）和嗜线虫沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）［5-7］。本课题组从平顶山地区采集的异小杆属昆虫病原线虫肠道内分离到2株具有较高杀虫活性的共生菌株LY2W 和NK，通过其形态、培养和生理生化特征并结合16S rDNA序列分析等手段将其鉴定为肠杆菌属（Enterobacter），为昆虫病原线虫共生菌活菌制剂的研制奠定基础。

昆虫病原线虫共生菌用于有害生物的防治，需要形成一定形态的制剂才能够被应用［8-9］。关于共生菌杀虫活性的农药剂型还鲜有报道，只在李立涛［9］的研究中，嗜线虫致病杆菌制剂对小菜蛾有良好的防治效果，50倍、100倍和200倍稀释液对3龄小菜蛾72 h的防治效果分别为97.56%、90.24%和80.49%。因此加强昆虫病原线虫活菌制剂的应用研究，在未来农业害虫综合防治中将发挥重要作用。本研究旨在从昆虫病原线虫共生菌活菌制剂所需各种助剂，如紫外光保护剂、湿润分散剂、增稠剂、防腐剂中，筛选出适合微生物活体自身属性的助剂，以增强制剂中微生物体抵抗外界环境的能力，延长产品的使用期，保证其防治效果［10］，同时增加共生菌杀虫活性的农药剂型。

1 实验材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫与共生菌

①供试昆虫：3龄大蜡螟幼虫，网上购买，避光条件，湿度70%，温度25℃静置培养。②昆虫病原线虫共生菌：共生菌NK由本课题组提供。

1.1.2 培养基及主要药品

发酵培养基：葡萄糖18.0 g、蛋白胨36.0 g、硫酸钠4.5 g、硫酸镁3.9 g、磷酸二氢钾2.16 g、硫酸铵6.9 g、磷酸氢二钾2.34 g、蒸馏水3 L，调pH值至7.2～7.4；湿润分散剂：木质素磺酸钠、乳化剂OP-10、吐温80、乳化剂500＃、乳化剂600＃；增稠剂：羧甲基纤维素钠、黄原胶、聚乙烯醇、阿拉伯胶；紫外光保护剂：全脂牛奶、活性炭、木质素磺酸钠；防腐剂：山梨酸钾、尼泊金甲醋、脱氢醋酸钠；防冻剂：乙二醇；消泡剂：有机硅。

1.1.3 主要仪器

低温高速离心机（GL-21M）、恒温振荡培养箱（ZYW-2102C）、生化恒温培养箱（SHP-250）、超声波破碎仪（SCIENTZ-ⅡD）、高压蒸汽灭菌锅（GI60 DR）、恒温水浴锅（HH-S4）。

1.2 方法

1.2.1 菌体浓度的确定

将共生菌菌体沉淀用无菌蒸馏水分别配置成浓度40%、50%、60%、70%的菌悬液，以生理盐水作为对照，饲喂3龄大蜡螟幼虫，每个浓度饲喂20条大蜡螟幼虫，设置三个重复，观察大蜡螟幼虫死亡数，计算死亡率和校正死亡率［5］，选择杀虫活性最佳的共生菌浓度。

1.2.2 以杀虫活性为指标初筛各种助剂

共计对18种助剂进行筛选。分别配制10 mL 60%菌液+助剂、10 mL 60%菌液、10 mL生理盐水。每种样品饲喂20条3龄大蜡螟幼虫，设置三个重复。记录虫子的死亡情况。以杀虫活性为指标排除对其影响较大的助剂，达到初筛的目的。

1.2.3 复筛各种助剂以及确定其最佳浓度

湿润分散剂的复筛及浓度的确定、防腐剂的复筛、增稠剂的选择、紫外光保护剂的选择及浓度的确定均参考文献［9］。悬浮率测定参照《农药悬浮率测定方法》（GB/T14825-2006），冷储稳定性测定参照《农药低温稳定性测定方法》（GB/T19137-2003）。

1.2.4 共生菌NK水悬浮剂的活性检测

将共生菌NK水悬浮剂原液分别稀释10倍、50倍、100倍，加上原液共得到四组共生菌水悬浮剂，以生理盐水作为对照，饲喂3龄大蜡螟幼虫，通过观察幼虫死亡率检验共生菌水悬浮剂防治效果。

2 结果与分析

2.1 菌体浓度筛选结果

菌体浓度初筛结果如图1所示，当菌体浓度为60%时，在7～8 d校正死亡率稳定达到55.56%。因此，确定水悬浮剂中菌体浓度为60%。（注：折线图数值代表均值±标准误差，显著水平P≤0.05，下同）。

2.2 助剂初筛结果

各种助剂初筛结果如图2～图5所示。

图1 水悬浮剂中菌体浓度的初筛结果

图2 湿润分散剂初筛的确定

图3 防腐剂初筛的确定

图4 增稠剂初筛的确定

图5 紫外光保护剂、消泡剂、防冻剂初筛的确定

图2～图5反映各助剂与60%共生菌NK菌液以一定比例混合后随着时间的延长对3龄大蜡螟幼虫校正死亡率的影响。分析可知，虫子的死亡率都随着时间延长而增加，到7 d达到最高，8 d达到稳定。如图2所示，湿润分散剂吐温远远低于60%菌液校正死亡率，对菌液的杀虫活性明显具有抑制作用，在本次筛选过程中将其淘汰。而图3中，防腐剂的三种助剂均高于60%菌液的效果，在本次筛选中三者都保留。在图4中，增稠剂阿拉伯胶始终低于60%菌液校正死亡率，因此将其淘汰，而保留其他增稠剂。在图5中，消泡剂有机硅、防冻剂和丙三醇校正死亡率与60%菌液相比具有较好的增效作用，确定它们为最佳的消泡剂和防冻剂。紫外光保护剂木质素磺酸钠校正死亡率从第2天开始就低于60%菌液，因此将其淘汰，而保留具有增效作用的全脂奶粉和活性炭。

2.3 助剂复筛结果

2.3.1 湿润分散剂的复筛结果以及浓度配比的确定

根据图2结果对4种湿润分散剂进行复筛，结果如表1所示，根据悬浮率淘汰了乳化剂500＃，根据分散性淘汰了木质素磺酸钠。本试验筛选得到两种相对较好的湿润分散剂OP-10和乳化剂600＃，悬浮率均在91%以上。

表1 湿润分散剂的复筛结果

最佳湿润分散剂浓度配比的筛选结果见表2，根据悬浮率结果，当浓度比为2:4和4:2时，其悬浮率均达到90%以上。结合成本以及分散性考虑，最终确定其浓度配比为分散剂OP-10与乳化剂600＃比例为4:2时具有良好的增效效果。

表2 最佳湿润分散剂浓度配比的筛选结果

2.3.2 防腐剂的复筛结果

各防腐剂浓度如表3所示。

表3 各防腐剂浓度

根据图3结果对三种防腐剂进行防腐剂复筛，如表4、表5所示，根据正交试验得出各防腐剂复合配方的防腐效果差异较大，通过极差法分析，山梨酸钾、尼泊金甲酯和脱氢醋酸钠对应的极差值分别是55.56、33.32和77.77，说明脱氢醋酸钠的防腐效果最好，山梨酸钾次之，尼泊金甲酯较差。防腐效果累计值越大表示防腐效果越好，在进行防腐剂浓度水平选择时，选择防腐效果累计值最大所对应的浓度水平。如表3所示，0.2%山梨酸钾、0.03%尼泊金甲酯和0.2%脱氢醋酸钠的复合配方的防腐效果最好。

表4 正交试验对制剂的防腐效果

表5 各组防腐剂防腐效果的累计值

表6 最佳增稠剂的复筛结果

2.3.3 增稠剂的复筛结果

根据图4结果对三种增稠剂进行增稠剂复筛，增稠剂的复筛结果见表6，黄原胶悬浮率最大，且当黄原胶浓度为0.2%时，悬浮率最大；三种增稠剂各浓度的倾倒性只有0.2%黄原胶、0.05%聚乙烯醇和0.05%羧甲基纤维素钠合格。通过比较离心稳定性和冷贮稳定性，筛选最佳增稠剂为0.2%的黄原胶。

2.3.4 紫外光保护剂的复筛结果以及最佳浓度的确定

无论是化学农药还是生物农药，都容易受到阳光中的紫外光照射影响，导致杀虫活性降低。因此，筛选有效的紫外光保护剂已成为现代农药延长其持效期的重要手段。紫外光保护剂照射时间对杀虫效果的影响如图6所示。

图6 紫外光保护剂不同时间对共生菌杀虫效果的影响

由图6可知，随着照射时间（30 min、1 h、2 h、4 h、6 h）的延长，60%菌液的杀虫效果逐渐下降，而加入全脂奶粉和活性炭的菌液杀虫效果依然很好，且全脂奶粉的杀虫活性均高于活性炭，因此本实验最佳紫外光保护剂为全脂奶粉。

如图7所示，加入不同浓度的全脂奶粉，都能对菌体起到一定的保护作用，但是当全脂奶粉浓度为3%时，紫外光照射几乎不影响菌体的杀虫活性，因此，本实验选择最佳的紫外光保护剂为3%的全脂奶粉。

2.4 共生菌水悬浮剂最优配方

2.4.1 共生菌NK水悬浮剂性能指标检测结果

共生菌NK水悬浮剂检测结果如表7所示，共生菌NK水悬浮剂的最优配方为：细胞沉淀60%、山梨酸钾0.2%、尼泊金甲酯0.03%、脱氢醋酸钠0.2%、乳化剂OP-10为4%、乳化剂600＃2%、全脂奶粉3%、黄原胶0.2%、乙二醇5%、有机硅0.6%和水24.77%，其悬浮率达到90.56%，具有良好的离心稳定性和倾倒性；经过一周的冷贮静置，并无分层和析水现象，具有较好的冷贮稳定性。综上所述，昆虫病原线虫共生菌NK水悬浮剂各项性能指标良好。

图7 全脂奶粉的确定

表7 共生菌NK水悬浮剂性能指标检测结果

2.4.2 共生菌NK水悬浮剂的活性检测结果

共生菌NK水悬浮剂的活性检测结果如图8所示，由图8可知，共生菌NK水悬浮剂原液和10倍、50倍、100倍稀释液的校正死亡率分别是100%、88.89%、77.78%和61.11%，综合各方面因素考虑，推荐昆虫病原线虫共生菌NK水悬浮剂的使用浓度为10～50倍稀释液。

图8 共生菌水悬浮剂稀释液杀虫活性检测结果

3 结论

本次实验得出均符合各项指标要求的共生菌NK水悬剂最优配方：细胞沉淀60%、山梨酸钾0.2%、尼泊金甲酯0.03%、脱氢醋酸钠0.2%、乳化剂OP-10 4%、乳化剂600＃2%、全脂奶粉3%、黄原胶0.2%、甘油5%、有机硅0.6%和水24.77%，而且室内杀虫效果好。共生菌NK水悬浮剂稀释50倍，杀虫效果能达到77.78%。但和同类嗜线虫致病杆菌制剂对小菜蛾防治效果方面对比，共生菌NK水悬剂对大蜡螟的防治效果基本一样，但是本实验性能指标比嗜线虫致病杆菌制剂好，只是成本略高。其原因可能是本实验对象大蜡螟虫个体大，致死时间长，而在实际应用中针对韭蛆等个体小的害虫，配方可能还需要改变和完善。本实验研究增加了共生菌杀虫活性的农药剂型。后续将进行韭菜田间试验，从韭菜长势、韭菜害虫-韭蛆死亡情况及生物安全性等方面进行综合评价生物防菌活菌制剂的效果，研究出对韭蛆等害虫高效、环境安全、低成本和易保存的生物农药。