多种提取液浸提金线莲叶片叶绿素效果研究

甘勇辉 连建技

(1 漳州职业技术学院食品工程学院 福建漳州363000;2 儒兰(福建)生物科技有限公司 福建南靖 363600)

植物叶绿素含量与植物光合作用、营养吸收状况等密切相关，是植物生长期间对环境条件反应敏感的生理指标之一，被广泛作为栽培植物生长的常测指标项目。适时对植物叶绿素含量进行跟踪监测，能及时掌握植物生长状况，尤其是林下或大棚种植的阴生植物［1-2］。叶绿素a、叶绿素b在单色光区（红光区）具有不同吸收反应最敏感波长（峰）。根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，其各组分浓度与吸光度值之间可建立联立方程，通过测定混合液在相应波长的吸光度值，即可求得提取液中叶绿素a、b 含量，进而计算出单位叶片（嫩技段等）含叶绿素的量。分光光度计测定是目前叶绿素测定最常用方法［3-4］。金线莲（Anoectochilus roxburghii）为兰科开唇兰属，是名贵的中药材，因富含多糖、黄酮、生物碱等成分而广受消费者喜爱［5-6］。目前野生金线莲资源日益枯竭，现以人工大棚及林下仿野生栽培为主要种植生产方式。金线莲是阴生草本植物，因种植环境条件尤其是光照差异叶色变化辐度大，叶绿素含量变化测定是监测其生长状况的指标之一。叶绿素提取液制备传统方法是研磨法，此法存在叶绿素易见光分解、操作繁琐、洗涤容器易造成误差等不足，已有不少研究者采用浸提法，取得了较好效果，但已有报道均以阳生植物叶片为研究材料［2，7-12］。本研究同时采用5种叶绿素浸提剂，并对阴生植物金线莲叶片叶绿素进行浸提测定，比较分析其浸提效果，以筛选适宜的叶绿素浸提液。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材

供试品种为金线莲红霞，2019 年10 月以组培苗移栽于儒兰（福建）生物科技有限公司南靖云水瑶洋顶岽林下种植基地，于2020 年5 月16 日采样测定。

1.1.2 仪器及试剂

紫外可见分光光度计（UV-1800，PC 型，上海翱艺仪器有限公司）；甲醇、95%乙醇、80%丙酮、丙酮-乙醇混合液（按体积比1∶1 混合）、二甲基亚砜。上述药品除95%乙醇（上海国药）外均为分析纯或由分析纯药品与纯净水按体积比配制。

1.2 方法

1.2.1 提取液制备

选取生长一致的林下种植金线莲植株，剪取倒数第2 叶，擦净叶片。选取90 片叶随机分成3份，编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，每份30 片。取第Ⅰ份30 片叶以打孔器（直经12 mm）在每张叶片主脉两侧对应部位各取2个圆片并分开放至两个烧杯中，依次打取完30 个叶片，则共得2 小份，每小份30 个叶圆片。取其中1小份按圆片材料的多少由高到低分组为10、8、6、4、2 个圆片，分别作为1、2、3、4、5 五个处理，并把圆片剪成2 mm 细丝无损放入标记好的5 个具塞刻度试管中，5 个试管分别加入甲醇提取液至20 mL；取剩下的另1小份同样按10、8、6、4、2 个圆片分成1、2、3、4、5 五个处理，并把圆片剪成2 mm细丝无损放入标记好的5个具塞刻度试管中，5 个试管分别加入95%乙醇至20mL。取第Ⅱ份30 片叶片以上述同样方法取叶圆片并分做2 小份，每份分成5 个处理，同样地分别加入80%丙酮、丙酮-乙醇混合液（1∶1）至20 mL；再以第Ⅲ份30 片叶片以相同方法取2 小份，取其中的1 小份分成5 个处理，同样5 个试管分别加入二甲基亚砜至20 mL。把刻度试管封口后置室温暗处浸泡提取，待材料变白后吸取清液用紫外可见分光光度计比色测定吸光度值。分别以各对应提取液为空白调零。

1.2.2 指标测定

甲醇提取液用紫外可见分光光度计在665、650 nm 波长下测定吸光度，95%乙醇提取液在665、649 nm波长下测定吸光度，并依据文献［13］中的公式计算叶绿素含量。

80%丙酮、丙酮-乙醇提取液在663、645 nm 波长下测定吸光度，并依据文献［13］［14］中的公式计算叶绿素含量。

二甲基亚砜提取液在665、649 nm 波长下测定吸光度，并依据文献［14］［15］中的公式计算叶绿素含量。

1.2.3 数据处理

采用成对法t测验进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 叶绿素a浸提含量差异

由表1 可知，5 种提取液提取的金线莲叶绿素a含量：80%丙酮＞二甲基亚砜＞丙酮-乙醇＞甲醇＞95%乙醇。5 种浸提液中80%丙酮、二甲基亚砜两者的叶绿素a 含量都极显著高于甲醇和95%乙醇；丙酮-乙醇的叶绿素a 含量也显著高于甲醇和95%乙醇（表2、图1）。表明80%丙酮、二甲基亚砜、丙酮-乙醇等浸提金线莲的叶绿素a 的效果优于醇类。

2.2 叶绿素b浸提含量差异

由表1 可知，5 种提取液提取的金线莲叶绿素b 含量：80%丙酮＞丙酮-乙醇＞95%乙醇＞甲醇＞二甲基亚砜。80%丙酮、丙酮-乙醇和95%乙醇的叶绿素b含量极显著高于二甲基亚砜，甲醇的叶绿素b 含量显著高于二甲基亚砜（表2、图2）。在叶绿素a、b提取效果上，80%丙酮都有最好的表现，而二甲基亚砜则表现出较大的差异，对叶绿素b的提取不完全。

表1 五种提取液提取测定金线莲叶绿素含量

表2 金线莲叶绿素含量测定结果分析

图1 五种浸提液浸提叶绿素a含量

图2 五种浸提液浸提叶绿素b含量

2.3 叶绿素a+b浸提含量差异

由表1 可知，5 种提取液浸提测定的叶绿素a+b 含量：80%丙酮＞丙酮-乙醇＞二甲基亚砜＞95%乙醇＞甲醇。80%丙酮的叶绿素a+b 含量显著高于二甲基亚砜、极显著高于95%乙醇及甲醇，丙酮-乙醇的叶绿素a+b 含量显著高于95%乙醇、极显著高于甲醇（表2、图3）。结果表明：80%丙酮、丙酮-乙醇浸提测定叶绿素a+b 的效果好于二甲基亚砜、95%乙醇和甲醇。

图3 五种浸提液浸提叶绿素a+b含量

2.4 叶绿素a/b值差异

由表1 可知5 种提取液浸提测定的叶绿素a/b值：二甲基亚砜＞甲醇＞丙酮＞丙酮-乙醇＞95%乙醇。二甲基亚砜浸提测定的a/b值极显著高于甲醇、丙酮、丙酮-乙醇和95%乙醇（表2、图4）。二甲基亚砜（DMSO）浸提测定的叶绿素a/b值极显著偏高应与其提取叶绿素b效果差有关。

图4 五种浸提液浸提叶绿素a/b值

3 讨论

根据比尔定律，用于比色测定的溶液浓度不宜太高，否则会影响透光率，导致吸光度读数不准确，进而影响叶绿素含量测定的准确性［8，16］。本研究以5 种提取剂并采用5 个浸提浓度浸提测定金线莲叶片叶绿素含量值，结果显示由各处理浓度的吸光度读数计算的测定值匀较为稳定，说明在本试验叶绿素浓度范围内符合比尔定律的测定浓度要求。5 种提取剂浸提测定结果表现为80%丙酮、丙酮-乙醇混合液（1∶1）浸提测定的叶绿素a+b 值在5 种浸提液中居第一和第二位，且两种提取液浸提测定的叶绿素a+b、叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b 值等差异均不显著。说明丙酮或丙酮-醇混合液是浸提测定金线莲叶绿素的比较好的浸提液，浸提效果优于醇和DMSO。醇类浸提测定的金线莲叶绿素a+b值显著偏低，可能是醇类对叶部细胞浸透性较差，对相关色素萃取溶解不完全导致。

在本研究的5种提取液中，DMSO浸提测定的叶绿素a/b 值极显著偏高，这应该与叶绿素b 的分子结构特点有密切关系。叶绿a 与叶绿素b 结构上的差异在于第Ⅱ吡咯环上由一个甲基（-CH3）取代成一个羰基（-CHO），因此叶绿素b的极性增强了，而5 种浸提液中只有DMSO 是非极性溶剂，浸提叶绿素b的作用受到影响，浸提效率显著或极显著低于酮、酮-醇、醇提取液，进而影响了叶绿素a+b测定值（显著低于80%丙酮浸提测定值）及叶绿素a/b 值，此结果也可能与叶绿素b 在非极性溶剂DMSO 浸提液中稳定性较差、易分解有关，另外DMSO 也有一定的毒性。上述因素说明在选用DMSO作为叶绿素浸提剂时应慎重。

在本试验5种提取液浸提测定金线莲叶绿素含量中，叶绿素a+b 值最高为80%丙酮浸提，表明金线莲叶部具有较高的叶绿素a+b值和较低的叶绿素a/b 值（＜3.0），与阴生植物生长于遮阴环境下，要依赖较高密度的聚光色素以捕获更多的光能、完成必要的光合作用，以完成其生长周期的现象基本一致［17］。而金线莲组培种苗在移栽后对光照适应能力有所增强，且在较强光照条件下种植的金线莲植株木质化程度高，多糖含量相应提高，致于能承受多强的光照强度、叶绿素含量会呈现怎样的相应变化及其与生物量关系等，则有待进一步的研究。