Aha1 基因过表达对黑色素瘤细胞凋亡的影响

蒋智文，谢汶蓉，王 悦，刘新光，4，孙雪荣* （1.广东医科大学衰老研究所，广东东莞 523808；2.广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808；3.广东医科大学东莞科研中心，广东东莞 523808;4.广东医科大学生物化学与分子生物学研究所，广东湛江 524023）

AHA1(activator of heat shock 90kDa protein ATPase homolog 1) 为Hsp90 的协调分子伴侣，对激活Hsp90的ATPase 的活性至关重要[1]。研究发现，Hsp90 在恶性黑色素瘤患者的血清及恶性黑色素瘤组织中的表达明显上调[2-3]，并且高表达的Hsp90 已经成为黑色素瘤一种重要的分子标记[4]。使用Hsp90 蛋白的抑制剂抑制肿瘤细胞的增殖时，AHA1 的表达量却持续上调[5]，表明AHA1 的表达可能也与肿瘤的发生发展相关。有研究发现，AHA1 在骨肉瘤细胞中呈高表达[6]，并且Aha1基因的表达可以调节骨肉瘤细胞的增殖和细胞周期[7]。我们前期的研究结果表明，Aha1基因的表达参与调节恶性黑色素瘤细胞的增殖与细胞周期[8]，但是Aha1基因在黑色素瘤的形成过程中的作用尚未明了。本研究旨在研究Aha1基因是否参与黑色素瘤的形成以及对黑色瘤细胞凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

B16F10 细胞购自中国科学院上海细胞库，无特定病原体(SPF)级C57BL/6 小鼠购自中山大学实验中心。细胞培养基DMEM 和血清FBS 购自Gibco 公司。pCMV-HA 与pCMV-HA-AHA1 真核表达载体为本实验室前期自行构建的质粒。TRIzol 和LipofectamineTM3000 购 自Invitrogen 公司，PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒购自TaKaRa 公司，荧光定量PCR 试剂TransStart Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物。RIPA 裂解液购自北京索莱宝公司，蛋白酶抑制剂Cocktail 购自Thermo Scientific 公司，BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司，甲叉双丙烯酰胺购自Bio-Rad 公司，TEMED、过硫酸铵、SDS购自Sigma 公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore 公司，ECL 试剂盒购自Pierce 公司。AHA1抗体(sc-166065) 购自Santa-Cruz 公司，a-Tubulin 抗体(T5168)购自Sigma-Aldrich 公司。CCK8 试剂购自Dojindo 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 使用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基，在体积分数为5%CO2、37 ℃的细胞培养箱中对B16F10 细胞进行培养。

1.2.2 建立小鼠黑色素瘤B16F10 细胞移植瘤模型

以胰酶消化培养B16F10 小鼠黑色素瘤细胞后，使用PBS 重悬B16F10 细胞并进行计数，制备5×107个细胞的悬液。然后在SPF 级C57BL/6 小鼠的皮下注射0.1 mL 的B16F10 细胞悬液(即5×106个细胞)。每次接种5 只小鼠。观察并记录接种B16F10 细胞后的C57BL/6 小鼠身体质量、成瘤时间和肿瘤大小等信息。

1.2.3 小鼠黑色素瘤和瘤旁组织的收集 C57BL/6小鼠成瘤14 d 后，脱颈处死小鼠后，解剖取出小鼠黑色素瘤和瘤旁组织，然后立即浸入液氮罐进行速冻。速冻后立即分别提取组织的mRNA 和总蛋白质，或将速冻后的黑色素瘤和瘤旁组织冻存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.4 小鼠黑色素瘤和瘤旁组织中总mRNA 和总蛋白质的提取 取液氮速冻的小鼠黑色素瘤和瘤旁组织，以研磨机进行研磨后，用TRIzol 试剂提取组织中的总RNA，然后以PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂将mRNA 逆转录成cDNA，置于-20 ℃冰箱中保存备用；使用RIPA(添加蛋白酶抑制Cocktail) 裂解研磨后的小鼠黑色素瘤和瘤旁组织，再采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定提取组织中的总蛋白，立即进行SDS-PAGE，或-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.5 定量PCR 使用Aha1的引物(上游5′-CAG AGGGACACTTTGCCACCA-3′，下 游5′-CTCGACCTT CCATGCACAGCT-3′)，内参β-Actin 基因的引物(上游5′-TGCGTGACATTAAGGAGAAGC，下 游5′-AGGAAG GAAGGCTGGAAGAG-3′)，进行定量PCR，测定Aha1基因在小鼠黑色素瘤和瘤旁组织中的mRNA 水平。

1.2.6 免疫印迹检测 配制12%分离胶后，将测定浓度后并蛋白变性后的蛋白质加入浓缩胶中，行SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳结束后进行湿法转膜，转膜后的PVDF 膜使用5%脱脂奶粉在室温条件下进行封闭，然后加入一抗于4 ℃条件下孵育过夜，TBS+1‰ 吐温洗3 次，加入二抗并于室温条件下孵育1 h，再用TBS+1‰ 吐温洗3 次，最后ECL 化学发光液，于Azure Biosystems C400 凝胶成像系统曝光拍照。结果使用mage J 进行灰度值分析，实验至少重复3 次。

1.2.7 细胞增殖检测 取对数生长期的B16 细胞接种至96 孔板，每组设4 个复孔。继续培养24 h，待细胞贴壁后，使用LipofectamineTM 3000 试剂，遵照操作说明分别转染空载体pCMV-HA(对照组)和AHA1的过表达载体pCMV-HA-AHA1(实验组)。继续培养48 h 后，每孔分别加入10 μL 的CCK8 试剂，然后转移至细胞培养箱继续培养1 h 后，使用多功能酶标仪测定细胞在450 nm 处的吸光度。

1.2.8 AnnexinV-FITC/PI 双染检测细胞凋亡 取对数生长期的B16 细胞制成5×105个/mL 单细胞悬液，取2 mL 接种于6 孔板中。继续培养24 h 后，使用LipofectamineTM 3000 试剂分别转染空载体pCMVHA(对照组)和AHA1 的过表达载体pCMV-HAAHA1(实验组)。转染48 h，使用胰酶消化细胞，2 000 r/min离心10 min 后，经PBS 漂洗，再用1×Binding Buffer，重悬细胞至1×106个/mL。取细胞悬液100 μL 至流式管中，按AnnexinV-FITC/PI 试剂盒操作说明，依次加入FITC-Annexin V 和PI 溶液，室温避光孵育30 min 后，使用BD FACS CantoⅡ流式细胞仪(BD，USA)进行检测。最后使用FlowJo 7.6 软件对细胞凋亡的结果进行分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Aha1 基因在黑色素瘤及瘤旁组织中的表达

提取小鼠黑色素瘤及瘤旁的组织后，分别提取RNA 后，采用qRT-PCR 的方法检测发现，小鼠黑色素瘤旁的组织中Aha1基因的mRNA 水平约为黑色素瘤中的2 倍(图1a);提取小鼠黑色素瘤及瘤旁组织，然后分别提取组织中的蛋白，采用免疫印迹的方法检测发现，黑色素瘤旁中的AHA1 蛋白显著高于黑色素瘤组织(图1b)。上述结果表明，黑色素瘤中Aha1基因的表达显著低于黑色素瘤旁的组织中的表达。

图1 Aha1 基因在黑色素瘤及瘤旁组织中的表达

2.2 AHA1 过表达对黑色素瘤B16F10 细胞增殖的影响

在B16F10 细胞中，AHA1 过表达48 h 后，B16F10细胞在450 nm 处的吸光度为0.44±0.08，而转染pCMVHA 空载体的B16F10 细胞(对照组)在450 nm 处的吸光度为0.26±0.05，差异有统计学意义（P＜0.05)。

2.3 AHA1 过表达对B16F10 细胞凋亡的影响

在B16 细胞中过表达AHA1 蛋白后，流式细胞术检测得到AnnexinV-FITC/PI 双染双变量散点图。与对照组相比，AHA1 蛋白过表达导致早期凋亡率(Q3)和晚期凋亡率(Q2)明显上升(如图2 所示)。AHA1 的过表达导致B16F10 细胞的总凋亡率(Q2+Q3) 显著增加(P＜0.05)，见表1。

表1 AHA1 过表达对B16F10 细胞凋亡的影响 (±s，n=3)

表1 AHA1 过表达对B16F10 细胞凋亡的影响 (±s，n=3)

与对照组比较:aP＜0.05

图2 AnnexinV-FITC/PI 双染法检测AHA1 蛋白对黑色素瘤B16F10 细胞凋亡的影响

3 讨论

恶性黑色素瘤是一种源于黑色素细胞的发病隐匿、侵袭性强、致死率高的高度恶性肿瘤[9]。Hsp90 为黑色素瘤一个重要的分子标记物，在恶性黑色素瘤及普通黑色素瘤细胞高表达[10]，并且Hsp90 蛋白在转移性黑色素瘤的表达量高于原发性黑色素瘤的表达量[2-4]。AHA1 作为Hsp90 的协同伴侣分子，与Hsp90相互作用后促进Hsp90 蛋白构象的变化进而激活Hsp90 蛋白的ATPase 活性[11]。Aha1表达是否与恶性黑色素瘤的发生相关，目前尚未见文献报道。但基于AHA1 对黑色素瘤其中一个标记物Hsp90 蛋白的ATPase 活性的激活作用，推测Aha1可能也与黑色素的形成相关。通过比较小鼠黑色素瘤与瘤旁组织中Aha1基因的表达，我们发现Aha1基因在黑色素瘤中的表达显著低于相应瘤旁组织。Aha1基因在膀胱癌、结肠癌、肝癌和肺癌等肿瘤中的表达显著高于相应的正常组织；然而Aha1基因在皮肤癌、卵巢癌和子宫癌中的表达明显低于相应的正常组织[12]。另据相关文献报道，抑癌基因TP53 在恶性黑色素瘤中只有10%～20% 存在突变，而在肺癌和结肠癌等肿瘤中存在高达80%～90%的突变[13]。这些研究结果表明，Aha1基因在不同肿瘤细胞中的作用可能不尽相同，并且Aha1基因在黑色素瘤中的作用可能与在皮肤癌、卵巢癌和子宫癌中的作用更相似，即低表达的Aha1基因更有利于恶性黑色素瘤的形成。

在黑色素瘤细胞中过表达Aha1基因，我们发现黑色素瘤细胞的生长受到抑制，细胞周期被组织在G1 期[8]，并且促进黑色素瘤细胞的凋亡。我们注意到，Aha1基因在骨肉瘤细胞中高表达，抑制骨肉瘤细胞中Aha1基因的表达，导致更多的骨肉瘤细胞进入细胞凋亡程序[7]。表明Aha1在恶性黑色素瘤与骨肉瘤中的作用迥异。高表达的Aha1可能有利于骨肉瘤的形成；而在恶性黑色素瘤中，高表达的Aha1通过促进黑色素瘤的凋亡，抑制黑色素瘤细胞的增殖，进而抑制黑色素瘤的形成。总之，本研究发现高表达的Aha1能够通过抑制黑色素瘤的生长，促进黑色素细胞的凋亡，进而抑制黑色素瘤的形成。然而Aha1在恶性黑色素瘤中的分子机理还有待更进一步的研究。