核桃黑斑病致病性泛菌的分离鉴定及壳聚糖抑菌的研究

彭子嘉 杜家明 沈阔程 隋韵静 李 涛 肖永生 余仲东

（1. 西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；2. 通江县林业局，四川 通江 636700；3. 四川省森防检疫站，四川 成都 610082）

核桃是我国重要经济林树种[1]，种植面积和产量均位居世界第一，陕西是我国主要栽培区域之一[2]，面积接近67万hm2，其中商洛市是陕西省的重要核桃产区。近年来，核桃产业为助力“三农”建设起到了重要作用，但核桃频受病虫害侵袭，每年造成800 t左右的巨大损失[3]，核桃黑斑病是近年来陕南核桃上的重要病害。核桃黑斑病每年4—8月间由于湿暖的气候条件，病害发生较重，可为害果实、叶片、嫩梢、叶柄、顶芽、花器等部位，表现出叶片变黑干枯、果实腐烂脱落等病状，最终导致核桃严重减产[4]。核桃黑斑病普遍认为是黄单胞杆菌属（Xanthomonassp.）细菌引起，典型的种为油菜黄单胞杆菌核桃致病变种（Xanthomonas campestrispv.juglandis）和树生黄单胞杆菌核桃致病变种（X.arboricolapv.juglandis）[5-6]，后者在意大利、希腊等欧洲国家有报道。除了上述主要致病菌外，尚存在其他致病病原菌，如胡桃盘二孢菌（Marssonina juglandis）[7-8]。近年来，相关学者分别在意大利、法国、中国山东和甘肃陇南等国家和地区分离出了成团泛菌（Pantoea agglomerans），并认为该菌可能和核桃顶端褐色坏死、叶片病斑有关[6-7,9]。因此，尽管核桃黑斑病症状相似，但确实存在不同气候区或者区域内病原菌可能不同的问题。

由于传统的农药防治会对环境、人畜健康产生一定危害，因此，核桃黑斑病无公害的绿色防治手段越发受到重视。壳聚糖具有广谱抗菌性、诱导果实抗病性等功能，对水稻等作物抗逆、抗病虫害有明显提升效果[10]；而壳聚糖盐具有制备方法简单、使用方便安全、绿色环保和长期稳定等优点，具有广阔应用前景[11]。但是，壳聚糖价格昂贵，抑菌效果在不同病原菌种中有所不同，需要进行浓度优化[12]。本研究对陕南地区感病的核桃果实及枝条样品进行了病原分离，并对所分离的病原细菌进行致病性测定、形态观察、16S rDNA和gyrB基因序列分析和壳聚糖抑菌试验，以确定陕南地区核桃黑斑病病原菌种类及防治方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

核桃黑斑病病果、病枝采自陕西南部山阳、商南、丹凤、商州等县区；供试的壳聚糖盐酸盐（pH 5.6）、壳聚糖乳酸盐（pH 6.1）均购自浙江金桥药业。

1.2 病原菌的分离

采用组织分离法和组织悬液法进行病菌分离[13]。组织分离法是将获得的病组织置于PDA平板上，每皿放3片组织块；组织悬液法是将获得的组织悬液在LB平板（胰化蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，1 000 mL水，pH 7.2）上划线，25 ℃下黑暗培养72 h后，挑取其中优势菌落进行划线培养，获得单菌落纯培养物。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 致病性测定

根据柯赫氏法则，选取枝条顶部的第2～3片叶片、20 d果龄的青果及嫩枝（15 cm）若干，经清水和无菌水清洗，再用70%乙醇表面消毒后备用。叶片接种菌株采用微针刺法。在无菌培养皿（9 cm×9 cm）中放入无菌滤纸，加入1 mL无菌水以湿润滤纸，将叶片平整置于皿内，使叶柄基部紧贴滤纸以吸收水分；用带菌注射器针头轻轻刺伤叶表接种，接种浓度为1×106cfu/mL。以微刺伤接种无菌水和直接喷菌液接种作为对照，每个菌株设6组重复，培养皿用封口膜密封，于温室中25 ℃、每天12 h连续光照培养。症状出现后按1.2中的方法再次分离病原菌。青果接种，将培养皿换成透明塑封袋（15 cm×7 cm），其余操作与上述叶片接种一致。嫩枝接种前将嫩枝上的叶片修剪干净，放入无菌培养皿中（16 cm×16 cm），在皿中的无菌滤纸上加入2 mL菌悬液（1×106cfu/mL），对照组加2 mL无菌水，其余操作也与叶片接种一致，每处理6个重复。

1.3.2 形态观察、革兰氏染色及过氧化氢酶活性测定

针对在回接试验中表现出病害典型症状的菌株，进行形态观察、革兰氏染色及过氧化物酶活性的测定。形态观察利用场发射扫描电子显微镜（S-4800 SEM，Hitachi，Tokyo，日本）进行[14]；革兰氏染色及过氧化物酶活性的测定，参照方中达[13]所述方法进行。

1.3.3 菌株的分子鉴定

1）病原细菌总DNA的提取。待测菌株用LB液体培养基于28 ℃摇床（160 r/min）培养48 h，在转速8 000 r/min下离心1 min后进行菌体收集。采用DNA快速抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，B518225-0050）提取细菌基因组DNA。

2）病原菌16S rDNA与gyrB基因序列测定。根据细菌16S rDNA的通用引物27F/1492R进行PCR扩增[15]，反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。此外，根据细菌gyrB基因引物F1/R1进行PCR扩增[16]，反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min[1]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。总反应体积为25 μL，其中2×Es Taq MasterMix（Dye）（北京康为生物科技有限公司）12.5 μL，引物各1 μL，DNA底物2.5 μL，dd H2O 8 μL。反应完成后，取3 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

3）PCR扩增产物测序和分析。纯化后的PCR产物由北京奥科生物科技有限公司进行双向测序；用软件Bioedit 7.2.5对序列修订和拼接后，利用blastn软件在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站上进行序列同源性比对，下载模式菌株的同源序列；用软件Clustalx 1.81将所有序列对齐，再用软件MEGA 5.0分别构建基于16S rDNA和gyrB基因序列的邻接系统发育树，自展法（bootstrap）循环抽样检测1 000次[17-19]。

1.4 壳聚糖盐溶液抑菌浓度的筛选

1.4.1 最低抑菌浓度范围筛选

在5 mL蒸馏水中加入0.1 g壳聚糖盐酸盐，搅拌溶解（原浓度20 g/L），121 ℃高温湿热灭菌20 min。3排无菌试管每排10管，编号1～10。采用倍比稀释法，向1～9号管管中依次加入5 mL终浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039 g/L的壳聚糖盐酸盐溶液，在10号管中加入5 mL无菌水。在1～10号试管中分别加入0.1 mL菌液（浓度1×106cfu/mL），10号管作为对照，参照冯小强等[20]的方法将所有接种管置于28 ℃、180 r/min条件下培养72 h，在紫外分光光度计（UV-5200，日本岛津）OD600下测定菌液浓度，空白液为无菌水，OD值为0即为壳聚糖最低抑菌浓度。对壳聚糖乳酸盐的最低抑菌浓度筛选方法同上。

1.4.2 最低抑菌浓度的确认

在确定抑菌浓度范围后，对下限浓度采用琼脂扩散法确定有效最低抑菌浓度。首先按倍比稀释法配置各浓度梯度壳聚糖盐溶液4 mL，并加入0.5 mL菌液（含菌量1×106cfu/mL）摇匀。取混合液1 mL于平皿内，倒入45 ℃的LB培养基（胰化蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，水1 000 mL，pH 7.2），边倒边混匀，3次重复。此外，再设2份对照平皿，一份直接倒入LB培养基，作为阴性对照；另一份加入含0.5 mL/L相同浓度菌液的LB培养基，作为阳性对照。置培养箱中黑暗培养（28 ℃，72 h）后观察。以平板中无菌落生长培养皿的壳聚糖盐浓度为抑菌最低浓度[21]。

2 结果与分析

2.1 菌株致病性测定

从病果、病枝中共分离和纯化出不同特征的细菌单菌落6个，分别命名为菌株HB、HC、HD、HE、HF、HG，HB在山阳、丹凤、商州均有发现，分离率最高，均在95%以上。

采用微刺法接种各单菌落实验表明，HB的6个接种叶片中有5个在3 d后叶表出现水渍状黑色大斑（图1a）；6 d后病斑逐渐扩大延伸、连结成片、颜色变深，病状不受叶脉限制，接种处有菌脓出现（图1c），HC的1个接种叶片有轻微的褪绿状；其余30个接种叶片均不发病；对照组叶片没有发病症状（图1b，d）。

HB的6个接种青果7 d后果实表面产生明显的褐色小斑点（图1e）；接种14 d后果实表面的褐色斑点扩大连片、形成凹陷（图1g）；其余5个菌株的30个接种青果不发病；而对照组青果没有表现出症状（图1f，h）。

HB的4个接种嫩枝5 d后，伤口部位出现褐色小斑且失绿（图1i）；接种10 d后出现大面积斑点且失水萎蔫（图1k）；其余32个接种嫩枝出现不同程度萎蔫状；对照组嫩枝没有斑点，没出现明显的感病症状（图1j，l）。

6个供试菌株中只有HB具有明显的致病性，发病症状和田间症状高度相似。从人工接种发病的叶片、果实、枝条重新进行病原菌组织分离，均得到类似HB的菌落。其余菌株无分离物出现。实验表明：HB菌株具有致病性，可从伤口侵入，3 d即发病，能侵染和为害核桃的果实、嫩枝、叶片，形成典型黑斑症状。

图 1 菌株HB回接核桃的发病症状Fig. 1 Symptoms on walnut inoculated by the isolate HB

2.2 菌株HB的形态特征

在LB培养基上，菌株HB菌落为圆形，表面湿润，光滑有光泽，边缘整齐；稍凸起，粘稠状，黄色半透明（见图2a）。菌株呈短杆状，菌体大小为（0.35～0.5）μm×（0.6～1.0）μm，鞭毛周生，菌体二分裂繁殖（图2b）。革兰氏染色为阴性，过氧化氢酶活性呈阳性。

图 2 菌株HB的菌落特征及扫描电镜图片Fig. 2 Colony characteristics and SEM photographs of isolate HB cells

2.3 菌株HB的分子系统学鉴定

16S rDNA PCR扩 增 得 到 的 片 段 长 度 约 为1.5 kb，序列blast搜索结果显示，序列同源性较高的都是泛菌属细菌。选取并下载GenBank中与菌株HB同源性较高的模式菌株的序列，构建的NJ系统发育树显示，菌株HB的遗传距离与欧文氏杆菌（Erwinia typographi）远，与泛菌属细菌近，但不能区分泛菌属种间差异（图3）。

图 3 基于16S rDNA基因的菌株HB的NJ系统发育树Fig. 3 Phylogentic tree of 16S rDNA gene sequences of HB by the neighbor joining

由于16S rDNA基因对亲缘关系较近的细菌不能准确鉴定种间关系，为进一步确认菌株HB的系统发育地位，继续进行gyrB基因的PCR扩增，得到一条约1.2 kb的DNA片段。blast结果显示，泛菌属与菌株HB高度同源，菌株HB与P.agglomerans（CP014129）、P. vagans（CP002206）同源性都达到97%，而与其他序列的同源性及覆盖率都较低。选择GenBank中与菌株HB相似度较高模式菌株构建gyrB基因序列的NJ系统树表明，菌株HB与模式菌株P.vagans聚在一个单独的单系分支上而与其他泛菌区分开，泛菌属种间关系在gyrB系统树中被较好地得到了区分（图4）。

2.4 菌株HB的抑制实验

在壳聚糖盐溶液抑菌试验中，壳聚糖盐酸盐在2.5～5 g/L的浓度范围内可以抑制菌株HB的生长，当浓度为5 g/L时，试管中液体澄清，OD600为零，同阴性CK；2.5 g/L时，试管中液体呈现轻度浑浊（OD600=0.96）；低于2.5 g/L时，试管中液体随浓度降低，逐渐浑浊，菌体沉淀增多。确认最低抑菌浓度试验中，设定壳聚糖盐酸盐浓度梯度依次为5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.0、1.0、0 g/L。实验结果表明，壳聚糖盐酸盐浓度为3.5 g/L时，平皿内没有菌株HB的菌落生长；而浓度为3.0 g/L时，平皿内生长有3～4个病原菌菌落，结果见表1。当浓度低于3.0 g/L后，随着浓度的逐渐降低，平皿内菌落数逐渐增加，菌落也越密集。可知，壳聚糖盐酸盐抑制菌株HB生长的最低浓度为3.5 g/L。

图 4 基于gryB基因的菌株HB的NJ系统发育树Fig. 4 Phylogentic tree of gryB gene sequences of HB by the neighbor joining

表 1 壳聚糖盐酸盐和壳聚糖乳酸盐对菌株HB最低抑菌浓度的确定Table 1 Confirmatory test of CH/CL minimal inhibitory concentration to isolate HB

壳聚糖乳酸盐抑制HB生长的浓度范围为0.625～0.313 g/L，为确认最低抑菌浓度，设定浓度梯度依次为0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0 g/L。结果表明，壳聚糖乳酸盐抑制菌株HB生长的最低浓度为0.5 g/L，结果见表1。

实验结果表明，壳聚糖盐酸盐、乳酸盐对HB菌株均有一定的抑制作用。在相同浓度条件下，含壳聚糖乳酸盐的试管菌体沉淀少于含壳聚糖盐酸盐的试管，液体OD600更低。同时，最低抑菌浓度确定实验证明，壳聚糖乳酸盐的最低抑菌浓度（0.5 g/L）显著低于壳聚糖盐酸盐（3.5 g/L）。因此，利用壳聚糖乳酸盐对该病原菌进行防控的效果比壳聚糖盐酸盐更好，壳聚糖乳酸盐可以在用量更少的情况下满足防治要求。

3 结论与讨论

核桃黑斑病病原种类较多，有真菌性的[6,8]，也有细菌性的[6]。对细菌引起的核桃黑斑病，通常认为病原是树生黄单胞杆菌核桃致病变种。但从北京、甘肃陇南核桃黑斑病样品中分离到了油菜黄单胞杆菌（X. campestris）[4-5]。此外，成团泛菌也被证明是核桃黑斑病的伴生病原菌之一，相比黄单胞杆菌属细菌，在一定时期内其感染速度更快、侵染能力更强、危害更大，是核桃幼果早期变黑脱落的主要原因[6-7,22]。本研究从陕南地区核桃黑斑病样本上分离到的菌株中只有最后泛菌是致病的，它与Xanthomonas属细菌同源性低，与Pantoea属细菌的同源性高，均为革兰氏阴性，能产生过氧化物酶，有鞭毛周生等同属的特征；但gyrB分析显示HB与成团泛菌不同（图5），与最后泛菌模式菌株在97%的同源性下聚在一个单系分支上。因此，综合致病性、形态特征和16S rDNA、gyrB分析结果，将陕南核桃黑斑病原菌归属为最后泛菌的一个致病型。致病性测定表明，最后泛菌可以通过外部伤口侵入核桃果实、叶片、嫩枝等组织，形成典型的黑斑病症状。最后泛菌与成团泛菌在致病性上存在一定差异：与成团泛菌最快24 h可出现明显病斑相比[7]，最后泛菌最快需要近3 d（图1）；此外，成团泛菌主要依靠感染叶部伤口的方式实现传播，暂未发现茎干损伤会导致突出的感染症状，因此茎干处伤口不会提高病原菌的传播风险[7]；而本研究发现最后泛菌可对核桃嫩枝实现侵染且症状明显，导致嫩枝出现大面积斑点及失水萎蔫，但嫩枝的感染率不如叶片、果实高。

泛菌是一类广泛分布的植物病原细菌[23]。从河北玉米中分离出的分散泛菌（P. dispersa）和菠萝泛菌（P. ananatis），均可引起玉米植株叶鞘枯死卷曲，叶脉处出现黄色病斑，茎秆处产生黄褐色干腐[24]。在广东香蕉叶鞘腐病中分离到成团泛菌，可导致叶鞘变褐腐烂、植株凋萎枯死[25]。本文首次报道了最后泛菌是引致陕南地区核桃黑斑病的病原。

对于传统核桃黑斑病的防治，常见的农药有农用链霉素、石硫合剂等；对成团泛菌所引起的核桃黑斑病，有研究表明百菌清[22]、中生菌素、噻霉酮、氟啶胺和春雷霉素等药剂[26]均有较好的抑菌作用。但是，农药防治手段会造成农药土壤残留，对人畜健康也会造成一定危害。壳聚糖广泛存在于自然界中，是为数不多原料充足的可再生资源之一；其简单改性后得到的壳聚糖盐酸盐及乳酸盐，具备良好的广谱抑菌性、水溶性、成膜性、生物相容性以及生物降解性等诸多优越特性，且制备方便、使用简单、具有一定保健功能，可在食品、果蔬保鲜、以及防控细菌病害中发挥重要作用[10-11]。本研究表明水溶性壳聚糖盐能有效防治由最后泛菌引起的核桃黑斑病，作为果面保护剂，具有阻隔、抑菌效果（田间数据未公布），应用潜力大[27]；但还缺乏深入系统研究，今后应着重对壳聚糖分子结构与抑菌机理、各类壳聚糖衍生物的抑菌活性及效果、不同溶剂和酸碱性等条件对壳聚糖产物抑菌作用的影响，以及壳聚糖在病害防治方面的综合应用技术等方面开展研究[10,28]，以期为制定完整规范的核桃黑斑病无公害防治体系和方案提供依据。