铅及铅镉复合暴露对赤子爱胜蚓急性毒性效应及其掘穴行为响应

刘嫦娥，肖艳兰，谭佳欣，潘瑛，段昌群，孟祥怀，王朋，袁鑫奇

（1. 云南大学生态与环境学院/云南省高原山地生态与退化环境修复重点实验室，云南 昆明 650091；2. 云南省高原湖泊生态修复及流域管理国际联合研究中心，云南 昆明 650091）

随着市场经济的高速发展，人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造等工业活动日益增多，造成许多重金属如铅、镉等大量进入大气、水体和土壤中，引起严重的环境污染问题。现今全世界平均每年排放Hg约1.5×104t，Cu约340 t，Pb约500 t，Mn约1.5×107t，Ni约100×104t，世界各国几乎均存在程度不一的土壤重金属污染问题[1]；据《2014年中国土壤质量调查公报》显示，我国土壤镉和铅的点位超标率分别为7.0%和1.5%，是几种重金属中排名第一和第五的污染物。调查表明，我国每千克土壤的镉污染水平可达几十毫克，北京市某菜地土壤铅含量范围为13.2～78.8 mg/kg[2]，并且土壤中铅含量有逐年增加的趋势。此外，从污染来源角度分析，铅镉复合污染普遍存在，是由于元素镉主要伴生于铅锌矿中，铅锌矿床一直是镉的冶炼主要来源，炼铅锌排放的“三废”中含有大量铅锌镉。然而研究表明，土壤中铅、镉浓度过高会对几乎所有土壤生物的生存和生长产生负面影响[3]。

具有“生态系统工程师”之称的蚯蚓具有重要的生态价值，在污染土壤治理及修复领域逐渐成为研究热点对象。研究表明，蚯蚓在土壤结构的形成、促进土肥相融、提高植物营养[4]、改善土壤通透性、提高储水与保肥能力、促进土壤有机质的分解和转化[5]等方面起着十分关键的作用。同时，蚯蚓体表由于没有坚硬的角质层，因此对各种环境干扰和环境污染物都非常敏感。在这些环境变化下，蚯蚓行为、生理等均可以受到不同程度的影响。研究表明，蚯蚓的存活率、生长和摄食率等受到高重金属浓度的负面影响[3]。即使在相对低浓度下，重金属浓度与蚯蚓生理变化之间也存在显著的剂量依赖关系[6]。在重金属铅镉胁迫下，蚯蚓通过体表吸收和摄食土壤富集重金属，积累到一定量后，蚯蚓体内抗氧化酶活性会升高，以便去除体内多余的氧自由基；当重金属浓度过高时，体内抗氧化系统就会受到抑制，抗氧化酶活性也随之降低，这就是蚯蚓的生理适应代价。当然，蚯蚓除了生理调节外，还可以使用行为策略，如水平迁移，以避免严重的生理伤害[7]。但是目前对于蚯蚓行为研究有待深入。

以往对于蚯蚓洞穴网络结构的评估往往因为洞穴的不透明而面临挑战。为了弥补以上不足，圆柱体横截面上洞穴结构数据被用来分析和预测洞穴结构[8]。但预测模型中参数的获取较为复杂，剖面中洞穴结构、洞穴面积百分比、有机质含量及位置、洞穴深度等都要求十分准确，数据难以获取，且在操作过程中受人为因素干扰较重。因此2D玻璃装置被应用于土壤中蚯蚓行为的研究，虽然2D装置抑制了蚯蚓的横向运动，但该装置可快速便捷地观察蚯蚓的掘穴过程、洞穴结构以及洞穴内的运动状况，因此，2D装置在蚯蚓行为观察上的便利性被学者们所重视。目前，单一污染物对蚯蚓的急性毒性研究[9]与蚯蚓运动的最大深度、蚓穴长度日增加值[10]等方面的研究颇丰，但重金属复合污染下急性毒性效应研究及掘穴行为响应的研究少见报道。

基于此，本文首先通过滤纸急性毒性试验法[11]探讨了铅镉单一及复合污染对赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)的急性毒性效应，然后采用2D装置[12]评价蚯蚓对铅镉的掘穴行为响应，以期为土壤毒理诊断及科学评价铅镉的生态安全性提供理论支持，为蚯蚓掘穴行为的洞穴长度与深度作为潜在且有前途的生物标志物提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用重金属为CdCl2与Pb(NO3)2，均购自天津市风船化学试剂科技有限公司，99.0%分析纯。

供试动物：赤子爱胜蚓（Eisenia foetida），系寡毛目正蚓科爱胜蚓属，食碎屑类表栖型蚯蚓，对外源污染物具有广泛敏感反应，购自云南圣比科技有限公司。选用体重约300～500 mg，两月龄以上发育良好、环带明显、大小基本一致的健康蚯蚓于供试土壤驯养，前期培养一周后用于实验。

自制2D装置：由两个30 cm×42 cm（W×H）间隔3 mm，三周（左、右、下）围密封且上端开口的有机玻璃制成，详见图1。

实验土壤：在云南大学呈贡校区选取无人为干扰及污染的地块采集土壤，风干后过2 mm筛。土壤pH为5.54±0.14、总氮为155.40±31.27 mg/kg、总磷为317.50±52.87 mg/kg、有机质为8.77±0.58 g/kg 。摊成薄层与重金属混匀后，用于2D装置评价蚯蚓对铅镉污染的掘穴行为响应。

1.2 实验方法

1.2.1 蚯蚓的急性毒性研究 本研究参考欧盟推荐的滤纸接触法进行48 h急性毒性试验。将蚯蚓置于人工气候箱（温度20±2℃、湿度75%），清肠3 h，洗净后用吸水纸擦干。在每个放有直径9 cm滤纸的9 cm培养皿中添加1条赤子爱胜蚓，上层敷保鲜膜以免蚯蚓逃脱，在保鲜膜上扎数个小孔用以透气。将配置好不同浓度的CdCl2与Pb(NO3)2溶液加入培养皿中使滤纸刚好湿润，置于无光条件下培养，每个处理15个平行。分别在24 h、48 h统计蚯蚓的存活数，通过回归方程得到重金属处理浓度与时间和存活数之间的相关性，并计算LC10、LC20、LC25、LC30、LC40、LC50。

铅单一急性毒性研究的铅浓度设置为：0.00、133.33、266.67、400.00、533.33、666.67、800.00 mg/L。铅镉复合污染急性毒性研究采用铅镉单一急性毒性 的24 h、48 h的LC10、LC20、LC25、LC30、LC40、LC50作为各自浓度并对应地组成一组浓度。

1.2.2 采用2D装置评价蚯蚓对铅镉污染的掘穴行为响应研究 将土壤摊开成均匀薄层，喷施重金属溶液，充分搅拌均匀以确保土壤中重金属的均一性，固定两周后开始实验。根据急性毒性效应的LC50设计土壤处理浓度，铅浓度：0、50、100、150 mg/kg，铅镉复合处理为：0/0、48 mg/kg Pb+11.67 mg/kg Cd、96 mg/kg Pb+23.34 mg/kg Cd、144 mg/kg Pb+35 mg/kg Cd。将配置好处理浓度的土壤倒入2D装置中，调节土壤水分为50%，使得装置中土壤密度为1.25 g/cm3；然后在每个装置中投加1条蚯蚓，每个处理设6个平行；将装置置于黑暗且温度为17±1 ℃的培养箱中。每隔24 h用不同颜色彩铅笔在透明纸张描绘洞穴结构，持续7 d。观察蚯蚓洞穴结构，测定蚯蚓洞穴总长度、活动的每日最大深度。

1.3 测定方法

1）蚯蚓死亡判断方法。根据《化学品 蚯蚓急性毒性试验》（GB/T 21809-2008），以蚯蚓前尾部对轻微机械刺激没有反应为死亡判断标准。

2）蚯蚓洞穴结构的测定。用CorelDraw将描绘的蚯蚓洞穴结构图转化为矢量图，之后采用CAD测量洞穴总长度与每日最大深度。

1.4 数据处理方法

采用概率分析法计算24 h和48 h LC50及其相关的95%置信限（95%CI）。采用Marking相加指数法[13]对铅、镉联合毒性进行评价，公式为：S=Am/Ai+Bm/Bi。式中S为毒性相加之和，A、B分别为受试毒物，其中i、m分别为单一毒性LC50值及混合毒性中A、B的含量。若S≤1时，相加指数AI =1/S-1；S＞1 时，AI=1-S。当AI ＞ 0时，为协同作用；AI ＜0时，为拮抗作用；AI =0时，为相加作用。

所得实验数据用excel进行统计与图表处理；采用SPSS 19.0软件进行数据的显著性分析，实验结果以mean ± SD表示；采用单因素和双因素方差（ANOVA）统计分析差异性。

2 结果与分析

2.1 铅单一及铅镉复合污染下蚯蚓的急性毒性研究

蚯蚓刚接触铅镉时行为活跃，四处窜动。铅镉高浓度处理时，蚯蚓渗出黄色黏液，环带明显肿大。随着处理时间延长，少数蚯蚓出现死亡现象，死亡个体环带破裂，渗出黄色黏液，体表呈现颗粒状凸起，且存在蚯蚓断裂现象，死亡个体腥臭味较浓。同时，观察发现存活蚯蚓通过身体卷曲、减少活动等行为来减少与重金属的接触以维持生命。

2.1.1 铅污染下蚯蚓的急性毒性研究 铅污染下蚯蚓进行的毒性研究结果显示，24 h、48 h赤子爱胜蚓存活率与Pb2+浓度在0.05水平上双侧显著相关，相关性系数分别为0.901和0.925（表1），表明两者具有良好的相关性。

从表1可以看出，24 h和48 h的LC50分别为773.40 mg/L、439.33 mg/L。24 h和48 h的LC50值之比为1.76，低于暴露时间之比，表明Pb2+单一暴露下，暴露浓度增高，赤子爱胜蚓对Pb2+毒性的抵抗性略有增强，受到的毒性效应减弱。

土壤中污染物毒性均略低于滤纸染毒，因此后续掘穴行为响应研究结合铅48 h LC10（220.28mg/L）及本团队野外实地调查（矿区周围土壤样品）结果，以确保蚯蚓的存活，因此最终确定蚯蚓掘穴行为实验Pb2+浓度为0、50、100、150 mg/kg。

2.1.2 铅镉复合污染下蚯蚓的急性毒性研究 根据铅、镉单一急性毒性试验的结果[11]，使用两重金属污染物24 h、48 h的LC10、LC20、LC25、LC30、LC40和LC50值作为各自浓度并对应地组成一组浓度，详见表2。采用对数拟合对于混合物中Cd2+、Pb2+浓度与赤子爱胜蚓死亡率的拟合度极好（R²分别为0.938 6、0.998 0），因此LC50是科学合理的（表3）。

从表3可以看出，当Cd2+和Pb2+联合作用于赤子爱胜蚓时，24 h LC50为102.37 mg/L Cd2+和345.62 mg/L Pb2+；48 h LC50为84.20 mg/L Cd2+和239.55 mg/L Pb2+。根据铅镉联合急性毒性结果，低于铅48 h LC10（220.28 mg/L）和镉48 h LC10（77.29 mg/L），以确保蚯蚓的存活，确定蚯蚓掘穴行为复合处理铅镉浓度为CK、48 mg/kg Pb+11.67 mg/kg Cd、96 mg/kg Pb+23.34 mg/kg Cd、144 mg/kg Pb+35 mg/kg Cd。

2.1.3 铅镉对蚯蚓的联合毒性评价 采用指数相加法评价镉离子和铅离子的联合毒性效应，从表4可以看出，暴露时间24 h、48 h下，对蚯蚓的联合毒性AI＜0，其联合作用表现为拮抗。研究表明，不管污染物的联合毒性为相加作用，还是协同或拮抗作用，其毒性比单一污染物都有一个毒性增大倍数，按照吴声敢等[14]研究提供的有关污染物混合前后毒性增大倍数（BI）的计算公式：当AI≥0时,BI= AI+1.0；当AI＜ 0时, BI= 1/（1.0-AI）。对本次试验结果进行计算，表明混合后两种重金属的毒性比单种重金属毒性的增大倍数为0.25（24 h）和0.27（48 h）。

2.2 铅镉污染下蚯蚓的掘穴行为研究

图2展示了由赤子爱胜蚓在铅胁迫下掘穴行为中形成的洞穴系统。当土壤受到污染时，洞穴系统会发生很大的变化，洞穴长度和每日深度可以定量测定，洞穴系统的一般形状：每平方米的三节点数、四节点数、行动面积、弯曲度等可以定性描述。从图2可以看出，没有铅胁迫的土壤环境中蚯蚓的掘穴深度较长，弯曲度较大；而150 mg/kg铅胁迫下，蚯蚓的掘穴深度最短，且弯曲度较小。

表1 铅单一暴露对蚯蚓的急性毒性统计分析结果Table 1 Statistical analysis of acute toxicity of Pb2+ to earthworms

表2 复合急性毒性实验的浓度设置Table 2 The concentration of compound acute toxicity experiment setting

表3 铅镉复合暴露对蚯蚓的急性毒性统计分析结果Table 3 Statistical analysis of acute toxicity of Pb2+ and Cd2+ to earthworms

表4 Cd2+和Pb2+对蚯蚓的联合毒性评价Table 4 Evaluation of acute toxicity of Cd2+ and Pb2+ to earthworms

2.2.1 铅污染对蚯蚓洞穴结构的影响研究 蚯蚓洞穴总长度随铅处理浓度及暴露时间的变化关系如图3所示。从图3可见，蚯蚓洞穴总长度受处理时间的影响。对照组洞穴总长度其他暴露时间显著高于第1 d，且第7 d的洞穴总长度最长，为第一天的7.01倍，显著增加；50 mg/kg、100 mg/kg和150 mg/kg铅胁迫下，蚯蚓洞穴第7 d比第1 d长121.19 cm、75.49 cm和20.86 cm，可以看出随着处理浓度的增加，蚯蚓洞穴增加的总长度显著降低（P＜0.05）；通过蚯蚓洞穴长度与处理时间的回归分析，除了对照组外，蚯蚓洞穴长度与时间呈线性正相关关系（R2＞0.93）。

此外，蚯蚓洞穴总长度受处理浓度的影响。除处理第1 d外，其他时间蚯蚓洞穴总长度随着处理浓度的增加显著降低（P＜0.05）。除处理第一天外，其他处理时间的蚯蚓洞穴长度随着处理浓度的增加显著降低；50 mg/kg、100 mg/kg和150 mg/kg铅胁迫下，处理第2 d，蚯蚓洞穴长度比对照组分别降低52.70%、61.74%和90.21%，处理第7 d，分别降低11.89%、46.35%和83.97%，可见随着处理浓度的增加，洞穴长度降低越显著，蚯蚓活动能力显著降低。铅胁迫下蚯蚓在土壤中的每日最大深度如图4所示。

蚯蚓洞穴的最大深度受铅污染的影响与蚓洞总长度相似。洞穴最大深度随着时间的延长而增加。处理1～4 d，100 mg/kg 铅胁迫下，蚯蚓每日最大深度高于50 mg/kg，且第3 d和4 d达到显著水平，而5～7 d，蚯蚓每日最大深度低于50 mg/kg，但均不显著。对照组蚯蚓的活动范围为0～12 cm土层深度，主要是赤子爱胜蚓为表栖型蚯蚓类型。而暴露于铅污染下的蚯蚓大多都在0～10 cm范围内活动，但150 mg/kg 铅胁迫下蚯蚓每日最大深度为4.66 cm，活动性较差。

蚯蚓洞穴的最大深度随着铅浓度的升高而降低。处理第1 d时，蚯蚓大都在0～7 cm土层深度活动，各处理间差异性较小，但显著低于对照组。第2 d时，铅胁迫下蚓洞最大深度变化较小，且对照处理下大幅增加，150 mg/kg处理与对照组差异显著，且随着时间的延长该差异进一步降低，150 mg/kg铅胁迫下蚯蚓活动深度于7 d内分别为对照组的85.87%、83.34%、75.90%、75.94%、66.66%、58.95%、59.66%。对照组处理下蚯蚓在第7 d达到最大深度，而铅污染处理下蚯蚓均于处理第6 d达到最大深度。

通过铅暴露浓度与时间对蚯蚓掘穴行为的分析详见表5，洞穴长度、每日最大深度与掘穴时间、铅处理浓度均存在极显著的相关性（P＜0.01）；经双因素方差分析发现，铅暴露浓度和时间对洞穴每日深度影响不显著（P＞0.05），而对洞穴长度影响极显著（P＜0.001）。

表5 铅暴露浓度与时间对蚯蚓掘穴行为的双因素分析Table 5 Two-way ANOVA of lead concentration and time on burrowing behavior of Eisenia foetida

2.2.2 铅镉复合污染对蚯蚓洞穴结构的影响研究 蚯蚓洞穴总长度随铅镉复合处理浓度及暴露时间的关系如图5所示。由图5可知，蚯蚓的洞穴总长度受重金属浓度及掘穴时间双重因素的影响。48 mg/kg Pb + 11.67 mg/kg Cd胁迫下，蚯蚓活动于第5 d就停止了；144 mg/kg Pb + 35 mg/kg Cd胁迫下，蚯蚓活动第6 d停止了。各处理蚯蚓的洞穴总长度与对照差异显著，但各处理浓度间差异不显著。

蚯蚓在土壤中的每日最大深度如图6所示。蚯蚓洞穴的每日最大深度受铅镉复合污染的影响与蚓洞总长度相似。各处理蚯蚓的洞穴最大深度与对照差异显著，但各处理浓度间差异不显著。48 mg/kg Pb/11.67 mg/kg Cd、96 mg/kg Pb/23.34 mg/kg Cd、144 mg/kg Pb/35 mg/kg Cd胁迫下蚯蚓分别在0～6.76 cm、0～4.55 cm、0～4.54 cm的土层深度活动，显著低于对照组。

铅镉暴露浓度与时间对蚯蚓掘穴行为分析详见表6，洞穴每日最大深度与铅镉处理浓度存在极显著的相关性（P＜0.001）；经单、双因素方差分析发现，铅镉处理浓度、铅镉处理浓度×时间对洞穴长度影响极显著（P＜0.001）。

表6 铅镉暴露浓度与时间对蚯蚓掘穴行为的双因素分析Table 6 Two-way ANOVA of co-exposure of lead andcadmium and time on burrowing behavior of Eisenia foetida

3 讨论

3.1 镉、铅污染对蚯蚓的急性毒性危害

关于重金属对赤子爱胜蚓的急性毒性研究很多。研究表明，48 h镉离子对赤子爱胜蚓的LC50为23.41 ug/cm2、铅离子为48.21 ug/cm2[14]，高于Liu等[11]研究结果179.80 mg/L（8.48 ug/cm²）和439.33 mg/L（20.717 ug/cm2）。造成结果差异较大的原因可能包括赤子爱胜蚓的购买来源、滤纸大小差异与数据处理时曲线拟合的方式不同，文献中是将直径为11 cm的一层滤纸放入直径9 cm的培养皿中，即滤纸包住培养皿边缘，并采用一元一次直线方程进行拟合分析；而本实验数据采用拟合度较好的对数曲线进行分析。也有研究表明，48 h镉离子对赤子爱胜蚓的LC50为192.1mg/L[15]，认为造成差异的原因主要为供试生物选取、处理蚯蚓的数量、数据处理方法与试验仪器等方面有差别，文献中选取体重200 mg左右的赤子爱胜蚓（30条）在直径为12.5 cm的培养皿（垫5层滤纸）进行染毒，与本研究所用供试蚯蚓（300～500 mg）、培养皿（9 cm）相比蚯蚓更小而培养皿更大，可能存在染毒不充分且蚯蚓来源差异、前期生境、实验条件（温度、湿度等）差异等原因造成LC50与本研究结果存在差异。本研究表明，Cd2+对于赤子爱胜蚓的毒性为Pb2+的2.4倍。当然，不同重金属的毒性差异与重金属理化性质与结构不同、作用于机体的致毒机理不同有关，具体毒性作用机理有待进一步研究。此外，研究显示，铅离子对赤子爱胜蚓的毒性小于镉离子的毒性[14]，与本实验结果相同。

当污染物的物理化学性质相近时，由于作用途径和方式相似，其在生态介质（土壤、水体等）、代谢系统及细胞表面结合位点都会存在竞争；然而竞争的结果与污染物的种类、浓度比和吸附性等性质紧密相关。因此，关于铅镉对动物的急性毒性联合效应的研究结果不一。本研究采用指数相加法评价得出镉离子与铅离子的联合毒性效应为拮抗作用。研究表明：用铅镉联合对小鼠进行吸入染毒实验，表现为明显的协同作用[16]。此外，Cd与Pb表现为有协同作用或拮抗作用的，低浓度Pb与Cd复合作用的急性毒性效应表现出一定的协同作用，但高浓度的Cd与Pb联合作用表现出拮抗作用，还有Cd与Pb对联合毒性表现为相加效应，原因尚不明确。许多学者认为可能是实验条件的不同理化性质差异、供试生物购买批次或个体差异、金属离子在生态系统相互作用与竞争过程中影响重金属的可利用性、不同金属离子间的联合毒性、金属离子在生物体靶位点和生物体吸收位点上的相互作用等造成的[17]。

滤纸接触时蚯蚓染毒的实验方法十分简单快捷，可以快速的探究重金属毒性并建立剂量效应关系。但是滤纸染毒的操作方法只存在皮肤接触，未考虑蚯蚓新陈代谢与行为，不能反映客观自然环境的真实情况。相关研究发现，滤纸染毒与人工土壤实验中所得致死浓度差距较小，因此本研究滤纸染毒方法得到的LC50为后续掘穴行为响应研究的土壤重金属浓度设计提供参考。

3.2 重金属污染对蚯蚓掘穴行为的影响

在以往关于蚯蚓对重金属胁迫响应研究中，大部分关注蚯蚓体内重金属的积累、蛋白含量变化、抗氧化酶活性等生理响应。而蚯蚓掘穴行为更能直观的反应蚯蚓对污染土壤的响应。有关蚯蚓行为的研究大多集中在两室趋避效应上，蚯蚓为了规避毒害作用往往表现出远离污染源的运动规律[18]。规避是一种行为测试，具有快速、简单、便宜等优点，虽然不是毒性的定性测定，但是一种逃避行为的定量测定。例如，众所周知，蚯蚓会避开一些有气味的植物，如洋葱，这些植物实际上对它们没有毒性。施用农药后，在田间观察到蚯蚓的表面迁移也可视为规避的结果。随着重金属污染问题日益严重，作为土壤工程师的蚯蚓通过可调节性范围与机制的应对策略适应环境变化，其掘穴行为极大程度上决定着土壤结构的状态，比如增加土壤孔隙度[19]，影响土壤容重和土壤透气性，从而导致土壤养分循环及植物生产力的变化[20]。

本文研究了重金属胁迫下赤子爱胜蚓洞穴最大深度、洞穴总长度等发生显著改变，与重金属种类、浓度显著相关，但规避效应的生态意义有待详细研究。当然，采用蚯蚓洞穴最大深度、洞穴总长度、日增加洞穴深度与洞穴长度等可以表征蚯蚓掘穴能力与探索土壤的能力。蚓洞总长度代表了蚯蚓探索土壤的能力，在活动过程中能改变土壤有机质的空间分布，混合有机质与矿质土，形成富含有机质的土壤团粒结构，是蚯蚓改善土壤质量的主要影响因素，但重金属等污染胁迫显著抑制了蚯蚓对土壤掘穴的这一过程。本研究表明，50、100和150 mg/kg铅胁迫下，处理第7 d，蚯蚓洞穴长度比对照组分别降低11.89%、46.35%和83.97%。也有研究表明，0.5 mg/L和1 mg/L的吡虫啉显著改变了蚯蚓行为的洞穴长度、一段时间内的总行程和洞穴再利用率等[21]。可见，重金属污染降低了蚯蚓的运动能力，进而降低改良土壤结构和团聚体结构稳定性，而土壤质量的变化必然对蚯蚓肠道微生物和土壤微生物丰度与多度产生影响[22]，从而可能间接影响土壤生态功能及质量。

蚯蚓通过取食、掘穴等行为在土壤生态系统的养分循环与能量流动中发挥生态功能，其取食行为加速了有机质的破碎和分解，掘穴行为增加了微生物与凋落物的接触面积的同时加速了有机质的混合；分泌与排泄行为促进了微生物的生长与繁衍[23]，同时蚯蚓摄食大量土壤微生物，加速微生物组织的矿化，提高了土壤中可利用氮和磷含量，改善了土壤质量；蚯蚓掘穴运动不仅加速了表层凋落物向深层沉降，而且促进了有机质与矿质土的混匀，促使土壤团聚体的形成[24]，提高了土壤团聚体结构稳定性。而以上过程均受蚯蚓洞穴总长度以及最大深度的限制。除此之外，蚯蚓行为可以用蚯蚓洞穴系统的面积、拓扑结构、弯曲度和深度等表征[12]。

总之，急性毒性研究可以通过建立剂量-效应关系，对重金属的直接毒性与潜在风险进行评估[25]。但是蚯蚓在土壤中的运动状况及掘穴行为很难被观察，2D装置内蚯蚓的掘穴行为研究能很好的弥补以上问题[26]。蚯蚓行为不仅在评估重金属污染及风险评价方面较致死剂量更为敏感，而且蚯蚓行为是蚯蚓健康状况、对土壤改善能力、生态系统中能量转化的重要影响因素，同时在土壤生态系统中尤其是凋落物分解及物质循环方面具有重要意义。

随着重金属污染问题日益严重，作为土壤工程师的蚯蚓通过可调节性范围与机制的应对策略适应环境变化，其掘穴行为极大程度上决定着土壤结构的状态，比如增加土壤孔隙度，影响土壤容重和土壤透气性，从而导致土壤养分循环及植物生产力的变化。可见，蚯蚓行为是决定土壤生态过程的重要环节，通过分析蚯蚓行为的变化可以揭示土壤结构和功能转变的具体机制。蚯蚓是一种典型的土壤动物，是土壤动物区系的代表类群。蚯蚓对某些污染物非常敏感，因此利用蚯蚓作为土壤环境的指示生物，将蚯蚓抗氧化酶、溶酶体、总免疫力、热休克蛋白和DNA损伤等指标，同时结合蚯蚓行为指标作为土壤生物标志物具有潜在的重要科学意义。

4 结论

1）铅单一污染下赤子爱胜蚓的半致死浓度48 h LC50为439.33 mg/L，根据48 h LC50得出镉对赤子爱胜蚓的毒性为铅的2.4倍；铅镉复合污染时赤子爱胜蚓的48 h LC50为Cd2+84.20 mg/L和Pb2+239.55 mg/L，对蚯蚓的联合毒性AI＜0，因此，在实验条件下两者对蚯蚓的联合毒性效应为拮抗作用。

2）重金属胁迫下显著影响蚯蚓洞穴最大深度、洞穴总长度、日增加洞穴深度与洞穴长度等。随着铅单一、铅镉复合处理浓度的增加，蚯蚓洞穴总长度和每日最大深度与对照相比显著下降，50 mg/kg、100 mg/kg和150 mg/kg铅胁迫下蚯蚓洞穴总长度第7 d比第1 d分别长121.19 cm、75.49 cm和20.86 cm；48 mg/kg Pb/11.67 mg/kg Cd、96 mg/kg Pb/23.34 mg/kg Cd、144 mg/kg Pb/35 mg/kg Cd胁迫下蚯蚓分别在0～6.76 cm、0～4.55cm、0～4.54 cm的土层深度活动，显著低于对照组。