稻草秸秆发酵液的抑藻效应及其机理

胡春霞,陈 波,张庭廷,*

稻草秸秆发酵液的抑藻效应及其机理

胡春霞1,陈 波2,张庭廷1,2*

(1.绍兴文理学院元培学院,浙江 绍兴 312000；2.安徽师范大学生命科学学院,安徽 芜湖 241000)

为有效利用农业废弃物稻草秸秆进行抑藻,本研究对不同稻草秸秆进行了特定方式的发酵,测定了发酵液对常见淡水藻类的化感效应,探讨了其中抑藻作用强的发酵液抑藻机理.结果表明:与普通稻草秸秆发酵液相比,水稻分蘖枝发酵液对铜绿微囊藻的抑制效果显著好于普通稻草秸秆发酵液(<0.05),作用72h水稻分蘖枝发酵液抑制率为93.21%,168h为97.96%,而稻草秸秆发酵液120h抑制率为68.20%,168h抑制率反而显著下降,只有27.65%;前者Eh50为14.073h,后者为21.036h;水稻分蘖枝发酵液对蓝藻(铜绿微囊藻)和绿藻(蛋白核小球藻、斜生栅藻)3种淡水藻均有良好抑制作用,对铜绿微囊藻抑制作用最佳(<0.05).在水稻分蘖枝发酵液胁迫下,铜绿微囊藻叶绿素a以及藻蓝蛋白(PC)和别藻蓝蛋白(APC)含量下降,藻细胞叶绿素自发荧光值持续降低,藻细胞结构破坏.推测水稻分蘖枝发酵液的抑藻机制之一是将藻细胞光合系统作为其攻击的靶点从而抑制藻类生长,并最终破坏细胞结构,引起细胞凋亡.

水稻分蘖枝；化感作用；抑藻机理；光合作用

在水华治理的研究中,农作物废弃秸秆的化感抑藻作用由于其价格低廉、生态安全性好受到了高度关注.其中,有关水稻秸秆的抑藻效应有较多报道.有研究指出稻草浸泡液对铜绿微囊藻有良好抑制作用[1-3];而多数研究表明单纯稻草浸泡液抑藻效果并不显著[4-6],只有经过发酵的稻草才有抑藻作用,认为抑藻物质是在稻草发酵过程中形成的[7-8].对于稻草抑藻机制报道较多的是其对藻细胞光合作用的影响,叶绿素a的破坏、氧化作用、细胞损伤等[1,3,5].本课题组在前期研究中发现未经发酵的稻草抑藻效果不显著,而且稻草种类多,不同种类稻草的抑藻作用各异[1-4].为了充分挖掘和发挥稻草秸秆的抑藻效能,寻找到成本低、抑藻效果显著、生态安全性好的抑藻材料,本研究比较了经过特定发酵后的两种不同稻草秸秆发酵液的抑藻作用,探讨其中抑藻效能好的发酵液的抑藻机理,旨在为水华藻类控制以及废弃稻草秸秆的再利用提供理论依据和技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料

水稻秸秆()、水稻分蘖枝()采自芜湖火龙岗镇周边农田;水稻分蘖枝为水稻收获后根部重新生长分蘖出的青绿色分蘖枝.

铜绿微囊藻()、斜生栅藻()、蛋白核小球藻()均购自中国科学院武汉水生生物研究所藻种库. 铜绿微囊藻采用BG-11培养基培养,斜生栅藻和蛋白核小球藻采用HB4培养基培养;纤维素酶(食品级)购自南宁庞博生物工程有限公司;乳酸菌(食品级)主要成分保加利亚乳杆菌()、嗜热链球菌()、嗜酸乳杆菌()等购自佰生优生物科技有限公司;石油醚(AR)、氯仿(AR)、乙酸乙酯(AR)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂 RE 52-86A)、流式细胞仪FACSCantoⅡ(美国 BD)、气相色谱仪(安捷伦 GC 6890,FID)、质谱仪(安捷伦 5975inert- GC/MSD).

1.2 实验方法

1.2.1 藻种培养 实验前,对3种实验藻种进行扩大培养,使藻细胞进入对数生长期.向已灭菌的1000mL锥形瓶中加入100mL培养基,接入100mL藻液,充分摇匀后放入光照培养箱培养;培养条件设置为:光照强度4000Lx,光暗比12h:12h,温度(25±1)℃;之后每天加入100mL培养基,培养时间为7d,每天摇动锥形瓶3~4次[9-10].

1.2.2 稻草秸秆发酵液抑藻实验 将收集到的稻草秸秆(水稻秸秆、水稻分蘖枝)在自然条件下风干,剪成2cm小段,粉碎过40目筛网备用.称取两种秸秆粉末各30g分别放入500mL锥形瓶中封口,121℃高压蒸汽灭菌20min;冷却后,按照料水比(1:10质量比)加入超纯水;再按照秸秆粉末总量的1%添加纤维素酶和0.5%乳酸菌[11-12];封口,充分混合后置于35℃下厌氧发酵30d.最终分别得到水稻秸秆、水稻分蘖枝两种不同发酵液.发酵液均先用定性滤纸抽滤,再用0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物,定容到100mL,4℃保存备用.

取250mL灭菌锥形瓶9个,每个锥形瓶加入100mL对数期铜绿微囊藻,藻液初始密度为6.0× 106cells/mL,然后加入水稻秸秆或水稻分蘖枝发酵液,添加量为1.25%(/),同时设置空白对照组,每组3个重复,置于光照培养箱培养,培养条件同藻种培养.每24h取藻液用血球计数板进行藻细胞计数,计至168h.

1.2.3 水稻分蘖枝发酵液对3种淡水藻类的抑制作用 分别取对数期铜绿微囊藻、蛋白核小球藻和斜生栅藻(初始藻密度分别为3.5×106, 1.4×106和1.9×106cells/mL)3种藻液各100mL加入到灭菌的250mL锥形瓶中,再加入水稻分蘖枝发酵液,各设置0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、和1.25%(/)5个浓度梯度,同时设置空白对照组,每组3个重复,于1.2.2培养条件进行培养并计数.

1.2.4 水稻分蘖枝发酵液对铜绿微囊藻光合系统的影响 将对数期铜绿微囊藻用BG-11培养基稀释到1.3×106cells/mL;向已灭菌的500mL锥形瓶中接入300mL藻液,设置0.25%、0.35%、0.45%、0.55%和0.65%(/)5个浓度组以及空白对照组,每个浓度设置3个重复,置于光照培养箱中,培养条件同1.2.2,于实验第1,3,5d分别取样测定有关参数.

铜绿微囊藻叶绿素a含量测定参照文献[10];铜绿微囊藻自发叶绿素荧光的测定参照文献[13]方法,取藻液1mL,经300目绢筛过滤后移入样品管中,用流式细胞术(FCM)的PE-Cy5通道采集10000个藻细胞自发叶绿素荧光信号,激发波长488nm,进样流速12μL/min,每次采集数据前进样时间超过10s.用Flowjo软件计算所检测到的信号值,记为平均荧光强度,按以下公式计算叶绿素相对荧光强度:相对强度=实验组荧光强度/对照组荧光强度×100%

藻胆蛋白含量测定参照文献[14]方法,取藻液5mL,离心(10000r/min,10min),弃上清,加入5mL PBS (0.05mol/L,pH值6.8),置于-80℃冷冻8h,于室温下避光自然溶解,反复3~4次;再离心(10000r/min, 10min),取上清,测定620, 650, 565nm处吸光值,按公式(1)分别计算藻蓝蛋白(PC)和别藻蓝蛋白(APC)含量:

PC(mg/L)=(OD620-0.70OD650)/7.38(1)

APC(mg/L)=(OD650-0.19OD620)/5.65

藻细胞膜完整性测定方法参照文献[15],取藻液1mL,经300目绢筛过滤后移入样品管中,加入碘化丙啶(PI)使终浓度为0.0668g/L,25℃染色15min.用FCM的PE-Texax Red通道检测10000个藻细胞荧光信号,激发波长为488nm,进样流速12μL/min,每次采集数据前进样时间超过10s.用Flowjo软件计算所检测到的信号值,记为平均荧光强度,划分为正常群和激发群,分别统计占样品细胞的百分比.

1.3 数据处理

通过公式(2)计算抑制率:

式中:IR表示抑制率, %;表示不同处理组的藻密度, cells/mL;0表示同期对照组的藻密度, cells/mL.采用Excel 2003进行数据处理,通过SPSS 21.0软件对各组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并用最小显著性差异 (LSD)方法进行多重比较检验,<0.05表示有显著性差异,<0.01 表示有极显著性差异. 使用Probit计算时间序列上的Eh50(表示达到50%抑制效应所需要的时间)以及对3种藻的半效应浓度(EC50).

2 结果与分析

2.1 稻草秸秆发酵液的抑藻效应

2.1.1 两种水稻秸秆发酵液对铜绿微囊藻生长的影响 图1表示的是稻草秸秆发酵液及水稻分蘖枝发酵液对铜绿微囊藻生长的影响.两种发酵液在相同浓度时对铜绿微囊藻均有良好的抑制作用,与同期对照组相比均具有极显著差异(<0.01),但水稻分蘖枝发酵液具有更好的抑藻效应.由表1可知,72h时水稻分蘖枝发酵液抑制率就达到了93.21%,至168h其抑制率达到97.96%,而稻草秸秆发酵液在120h时抑制率才达到68.20%,在168h时抑制率反而显著下降,只有27.65%.两种发酵液的Eh50分别为21.036h (稻草秸秆发酵液)和14.073h(水稻分蘖枝发酵液),水稻分蘖枝发酵液不仅在很短时间内达到了半抑制效应,而且持续处于很高的抑制状态没有出现反弹.由此可见不同稻草发酵液可能因其含有的抑藻成分不同因而有不同的抑藻效能.

图1 两种不同水稻秸秆发酵液对铜绿微囊藻细胞密度的影响

表1 两种稻草秸秆发酵液对铜绿微囊藻的抑制率(%)

注:表中数据为平均值±SD(=3); 同一列,相同小写字母表示在0.05水平上无显著性差异;不同小写字母表示在0.05水平上有显著性差异;同一行,相同大写字母表示在0.05水平上无显著性差异;不同大写字母表示在0.05水平上有显著性差异,下同.

2.1.2 水稻分蘖枝发酵液对3种淡水藻类生长的影响 表2是不同浓度水稻分蘖枝发酵液对3种藻类的抑制率.总体看,不同浓度水稻分蘖枝发酵液对3种藻类均有一定抑制作用,且均具有浓度和时间相关性,即浓度越大抑制作用越明显,在实验期内,作用时间越长效果越好;除最低浓度组(0.25%),在实验期间表现为增长效应,抑制率为负值,其余浓度组发酵液对蓝藻的生长抑制作用远远好于对两种绿藻,具有统计学上的显著差异,<0.05或<0.01.作用96h时,最大浓度处理组对铜绿微囊藻、蛋白核小球藻及斜生栅藻的抑制率分别为95.66%、83.68% 和50.90%.但对于蛋白核小球藻,只有在发酵液浓度为1.00%和1.25%时才表现为抑制效应,而在3个低浓度组几乎均是增长效应,抑制率大多为负值;对斜生栅藻,在实验第24h时各浓度组均出现了抑制作用,但第48h时, 0.50%~1.25%组均出现了反弹,表现为增长效应,随着时间推移,各浓度组均为抑制作用.表3显示了该发酵液依次对这3种藻类作用72h的EC50值分别为0.257%、0.851%、0.910%,由此可看出水稻分蘖枝发酵液对蛋白核小球藻和斜生栅藻的EC50值分别是对铜绿微囊藻的3.3倍和3.5倍,说明该发酵液化感作用具有种属选择性,不同藻类对相同化感物质敏感性不同.

表2 不同浓度水稻分蘖枝发酵液对3种藻类的抑制率(%)

注:表中数据为平均值±SD(=3).

表3 水稻分蘖枝发酵液作用于3种藻的EC50及95%置信限(72h)

2.2 水稻分蘖枝发酵液对铜绿微囊藻抑制机理

2.2.1 对叶绿素a含量的影响 由图2可见,中高浓度实验组(0.55%,0.65%)第1d相较于对照组叶绿素a含量就具有显著性差异(<0.01);至第5d各实验组叶绿素a含量持续降低,与同期对照组相比均具有极显著性差异(<0.01),最小浓度处理组(0.25%)和最大浓度处理组(0.65%)叶绿素a含量仅占同期对照组的30.7% 和14.6%,说明发酵液对铜绿微囊藻叶绿素合成具有很强的抑制作用.

2.2.2 对自发叶绿素荧光的影响 由图3可看出水稻分蘖枝发酵液在时间和浓度两个序列上对铜绿微囊藻自发叶绿素荧光均有不同程度的影响.就时间序列影响而言,最小浓度处理组(0.25%)第1d占同期对照组的69%、第3d占44%,第5d仅占对照组的25%,其余各浓度处理组也均表现出相似的作用效果, 表明水稻分蘖枝发酵液作用于铜绿微囊藻时间越长抑制作用越显著;就浓度序列而言,浓度越高抑制效果越明显.综合浓度-时间看,随着发酵液添加量和作用时间延长对铜绿微囊藻自发叶绿素荧光影响越显著.

图2 不同浓度水稻分蘖枝发酵液对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响

**与同期对照组比较,<0.01

2.2.3 对藻胆蛋白含量的影响 由图4可看出实验第3d,相较于同期对照组,实验组PC含量均显著下降,<0.01,说明光合系统破坏严重,藻细胞利用光的能力下降;实验第5d,0.25%和0.35%的低浓度处理组PC含量仅占同期对照组的26.8%和22.0%,而3个高浓度组PC 含量更低,依次分别为对照组的11.9%、13.8%和15.6%.

图3 水稻分蘖枝发酵液对铜绿微囊藻自发叶绿素荧光的影响

不同小写字母表示同一浓度不同时间的差异显著,不同大写字母表示不同浓度同一时间差异显著

*与同期对照组比较,<0.05; **与同期对照组比较,<0.01

发酵液对APC 含量的影响也出现类似的变化.实验第1d各实验组APC含量就出现明显下降,均具有显著性差异(<0.05或<0.01).随着作用时间延长各实验组APC含量降低愈明显,第5d最大浓度组APC含量仅占对照组的33.8%.

2.2.4 对藻细胞完整性的影响

PI为大分子染料,只有当细胞膜受损后才能进入胞内与核酸物质相结合激发产生橙红色荧光,此时荧光强度增强,荧光强度同细胞膜受损程度呈正比.从图5可看出在实验第1, 3, 5d对照组激发群细胞占比始终维持在3%左右,这可能是藻生长过程中部分衰老细胞膜受损后PI结合核酸造成的荧光强度增强.而实验组第1d随着发酵液浓度增加激发群占比逐渐增多,最大浓度组(0.65%)占比达到了55%,至第5d占比达到75%;除最低浓度组外,各浓度组占比与同期对照组相比均具有极显著差异(<0.01).

3 讨论

近十多年来利用植物化感物质抑藻一直是研究的热点[16-17].其中,利用植物大麦秸秆抑藻则是迄今植物化感抑藻应用最为成功的案例[18].利用稻草抑藻的研究也较多,但所得结论却相差甚远[19-21],这可能跟实验时采用的条件以及所取的藻密度大小不同有关,与稻草种类或处理方式不同可能更有关.本研究采用普通稻草秸秆以及水稻分蘖枝,其发酵方式是在实验室反复摸索得到,即添加一定量纤维素酶以及乳酸菌并且发酵30d,两种发酵液对铜绿微囊藻均具有较佳抑制作用,但该研究首次发现水稻分蘖枝发酵液抑制作用显著好于普通稻草发酵液.同时,水稻分蘖枝发酵液对铜绿微囊藻的抑制作用也明显优于已发表的普通稻草抑藻文献结果[1,21].由于水稻收割后,稻茬很快即可长出大量分蘖枝,利用该分蘖枝发酵液进行抑藻既可收到非常好的抑藻效果,又可为稻田废弃秸秆的利用找到一种新的有效方式,环保且高效.

化感物质抑藻机制的报道很多[16-20],其中光合作用是藻细胞进行生命活动非常重要的环节.一些化感物质将光合作用系统作为攻击藻细胞的靶点,破坏叶绿素a以及藻胆蛋白,降低藻细胞利用光能同化产物的积累来达到抑制甚至杀死藻细胞的作用,本实验结果与前人研究的结论相似[22-23];同时PC和APC含量在水稻分蘖枝发酵液作用下也表现出相似的降低趋势,藻胆蛋白含量的下降可能是由于发酵液中化感物质破坏了叶绿素使得藻细胞利用光能能力下降以致其转化合成藻胆蛋白能力减弱造成的[23-24],而藻细胞叶绿素自发荧光值的持续走低也很好地佐证了这一结论的合理性.

完整且功能正常的细胞膜结构对细胞完成正常的生命活动至关重要.研究发现水稻分蘖枝发酵液会明显破坏藻细胞结构,当藻细胞受到超过其可调控的化感物质胁迫后会经历藻细胞聚集、细胞膜肿胀-萎缩直至最后溃缩死亡的过程,本实验通过PI染色分析藻细胞在水稻分蘖枝发酵液作用下的细胞膜完整性证实了这一现象,这与前人研究结果相吻合[24-25].

4 结论

4.1 稻草秸秆和水稻分蘖枝发酵液对铜绿微囊藻均有一定抑制作用,但水稻分蘖枝发酵液抑制作用显著强于稻草秸秆发酵液,其不仅在很短时间内达到了半抑制效应,而且持续处于很高的抑制状态不出现反弹,可作为稻草秸秆抑藻材料的首选.

4.2 水稻分蘖枝发酵液对蓝藻和绿藻的抑制作用具有一定种群选择性,抑制效果依次为:对铜绿微囊藻的抑藻效果>蛋白核小球藻>斜生栅藻,即对蓝藻的抑制作用显著好于对绿藻.

4.3 水稻分蘖枝发酵液对铜绿微囊藻的抑制机制之一可能是将藻细胞光合系统作为其攻击的靶点从而抑制藻类生长,并最终破坏细胞结构,引起细胞凋亡.

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Study on the algae inhibition effect and mechanism of the fermented liquid of rice straw.

HU Chun-xia1, CHEN Bo2, ZHANG Ting-ting1,2*

(1.Yuanpei College of Shaoxing University, Shaoxing 312000, China；2.College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)., 2021,41(4)：1925~1931

In order to use agricultural waste rice straws to inhibit algae growth more efficiently, this study experimented specific fermentation of different rice straws, measured the allelopathy performance of the fermentation liquids on common freshwater algae, and discussed the mechanism of fermentation liquid with strong algae inhibition. The results showed that compared with ordinary rice straw fermentation liquids, the fermentation liquid with rice tillering branch had significantly better inhibitory effect on(<0.05), and the inhibition rate after 72h treatment was 93.21%, then increased to 97.96% at 168h. With the treatment of the ordinary rice straw fermentation liquid, the corresponding inhibition rate at 120h was only 68.20%, then decreased significantly to only 27.65% at 168h. The Eh50was 14.073h for the former and 21.036h for the latter liquid. The rice tillering branch fermentation liquid had better inhibitory effects on cyanobacteria () and green algae (,), and had the best inhibitory effect on(<0.05) . Under the stress of rice tillering branch fermentation liquid, the contents of chlorophyll a, phycocyanin (PC) and allophycocyanin (APC) ofdecreased, the autofluorescence value of algal cell chlorophyll decreased continuously, and the algal cell structure was destroyed. It was speculated that one of the anti-algae mechanisms of rice tillering branch fermentation liquid might use the photosynthetic system of algae cells as its attack target to inhibit the growth of algae, and ultimately destroy the cell structure and cause cell apoptosis.

rice tillering branches；allelopathy；algae inhibition mechanism；photosynthesis

X173;X52

A

1000-6923(2021)04-1925-07

胡春霞(1976-),女,河南信阳人,讲师,博士,主要研究方向为微生物学.发表论文10余篇.

2020-09-01

国家自然科学基金资助项目(31170443)

* 责任作者, 教授, cyhztt@ahnu.edu.cn