畜禽粪便中氮磷及抗生素的高效检测方法研究进展
2021-04-30郝斯贝刘成斌陈晓燕
郝斯贝,刘成斌,陈晓燕,毛 舜
畜禽粪便中氮磷及抗生素的高效检测方法研究进展
郝斯贝,刘成斌,陈晓燕,毛 舜*
(同济大学环境科学与工程学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,上海 200092)
本文对目前粪便中氮磷和抗生素的常规检测方法和前沿检测技术进行了介绍,讨论了这些方法的技术瓶颈和未来研究方向,并得出以下结论:1)粪便样品的常规检测方法具有准确度高、灵敏度好的特点,但需要在专业实验室进行或需要使用大型仪器,难以满足原位快速检测或在线监测的需要,因此粪便中氮磷、抗生素检测新技术的研究十分必要;2)粪便中的氮磷、抗生素等成分可通过前处理方法提取,再结合简单、便捷的电化学法、荧光法等对其进行检测,以实现快速、原位分析或在线监测;3)粪便中污染物的高效检测技术在未来的发展空间和需求较大,将电化学法、荧光法等应用于粪便中氮磷、抗生素的检测需要持续深入的基础研究和技术创新.
畜禽粪便；氮；磷；抗生素；高效检测方法
畜禽粪便常通过堆肥处理施用于农田,但粪便中常含有氮磷等营养物质或抗生素等残留物,容易造成土壤或者地下水污染.《第二次全国污染源普查公报》[1]数据显示,通过对涉及全国2981个畜禽养殖业的区县、37.88万个畜禽规模养殖场的污染普查,2017年畜禽养殖业的排放污染物中含氨氮11.09万t、总氮59.63万t、总磷11.97万t;其中,畜禽规模养殖场排放污染物中含氨氮7.50万t,总氮37.00万t,总磷8.04万t.
当水中富含氮、磷元素时,会引起富营养化;氮、磷元素在土壤中形成硝酸盐和磷酸盐类物质,长时间的积累易破坏土壤结构,渗透进地下水造成污染[2-3].抗生素在畜禽养殖业中主要用于疾病治疗或促进生长,研究表明,我国畜禽养殖业每年使用的抗生素量约占全世界总量的70%[4].但畜禽仅能吸收少量抗生素,大部分随粪便排出体外,进入水环境和土壤中,引起环境中细菌等微生物产生耐药性,或被植物或水生生物吸收积累,或通过食物链进入人体体内,危害人类生命健康.因此,对于畜禽粪便中氮磷、抗生素的监测具有重大研究意义[5].
目前,关于禽畜粪便中氮磷的检测方法主要是参考我国行业标准《有机肥料(NY525-2012)》[6]中总氮、总磷的实验室化学分析方法.实验室化学分析法由于灵敏度较低,且检测需要使用化学试剂,不适合进行原位、在线检测.近红外光谱法相较于实验室化学分析方法具有绿色环保和可在线分析的特点,但其目前主要用于评估预测,准确度仍有待提高[7].液相色谱法是抗生素的标准检测方法,对于复杂基质具有较好的分离效果,与不同检测器联用可达到准确的定性定量分析;但色谱法需使用大型仪器设备,无法现场作业[8-9].随着对快速、灵敏、可现场部署、可在线监测和廉价传感器的需求不断增加,氮磷、抗生素的电化学、荧光检测方法[10-13]近年来得到了广泛关注和研究.相对于传统的检测方法,这类方法具有更低的检测限、更短的检测时间且操作便捷.作为前沿检测方法,电化学法和荧光法已被广泛应用于各种介质中的氮磷和抗生素检测,但其在粪便样品分析中的应用很少.对于粪便样品分析,可通过前处理提取其中的氮磷和抗生素,再利用电化学法、荧光法对其进行检测.因此,电化学法、荧光法在粪便中氮磷、抗生素的快速分析中具有很大应用潜力.
本文主要综述了近年来粪便中氮磷和抗生素的检测方法研究进展,其中包括了氮磷和抗生素的标准检测方法和新型检测方法,如近红外光谱分析法、液相色谱法等.并对应用于其他介质中的电化学及荧光等氮磷和抗生素检测方法进行了介绍,评价了其在粪便检测中的应用潜力.
1 氮、磷检测方法
粪便中氮磷的检测主要包括实验室化学分析方法和近红外光谱分析法.另外,电化学分析法也被用于氮磷检测,并在粪便样品的氮磷检测中展现了很大应用潜力.
1.1 氮、磷的标准检测方法
目前对粪便中氮、磷的测定暂无国家标准,主要是参考NY 525-2012标准[6]中有机肥料中总氮、总磷的检测方法.NY 525-2012总氮的测定方法是基于凯氏定氮法,主要包括3个步骤:消解、蒸馏、滴定.通过浓硫酸—过氧化氢消解样品,大多数有机含氮样品经消解转化为铵态氮,然后将碱化后蒸馏出来的氨用硼酸溶液吸收,以标准酸溶液滴定[14].关于磷的测定,标准中的测定方法是钼酸铵分光光度法.其原理是将有机含磷样品经过硫酸和过氧化氢消煮,在一定酸度下,待测液中的磷酸根离子与偏钒酸和钼酸反应形成黄色三元杂多酸.因在一定浓度范围内,黄色溶液的吸光度与含磷量成正比例关系,可用分光光度法定量测定;其主要测定物为总磷.目前研究中,许多工作参考以上标准方法对区域养殖场的畜禽粪便氮磷含量进行检测.如郭建凤等[15]、黄红卫等[16]通过利用凯氏定氮法检测了养殖场畜禽粪便中氮磷含量.凯氏定氮法虽能有效的检测粪便中总氮含量,但其需要使用许多化学试剂,且前处理过程较为复杂,耗时长.
杜马斯燃烧法是应用较多的另一种总氮检测法,其原理是:样品在900~1200 ℃高温下燃烧,产生混合气体,其中的干扰物被吸收剂吸收,而氮氧化物被全部还原成分子氮,随后被热导检测器检测[17].相对凯氏定氮法,其效率更高,每次测试只需几分钟;不使用化学试剂,绿色无害;其检测的氮不仅包括有机氮还包括无机氮,如亚硝酸盐及硝酸盐类,测总氮时更精准[18].沈秀丽等[19]的研究表明,杜马斯燃烧法和凯氏定氮法检测蛋鸡粪、肉鸡粪、猪粪、奶牛粪和肉牛粪中氮含量的准确性没有显著差异.
以上实验室化学分析主要还是以NY 525- 2012[6]中的检测方法为主,这类方法虽然精度较高,但耗时费力且无法进行原位快速检测或长期监测.因此,近红外光谱分析法作为一种高效、快速的氮磷检测方法,近年来受到研究者的关注.
1.2 近红外光谱分析法
基于耗时短、绿色环保、可在线分析及远程监控的特点,近红外光谱分析技术(NIRS)在近几年发展迅速.NIRS的原理是:在波长为780~2526nm范围,通过投射、漫反射的方式获取样品成分在近红外区含氢键基团化学键振动产生的吸收光谱;其不同光谱区域信号体现不同物质的信息,可根据光谱的形状与位置分析待测物的化学结构,并通过吸收峰的强度确定待测成分含量[20].将NIRS分析技术与偏最小二乘回归法(PLS)、人工神经网络法(ANN)等现代分析技术结合,建立光谱与待测物质成分之间的线性或非线性模型,从而实现利用NIRS技术对粪便中成分的检测[20-21].
Saeys等[22]通过实验室化学分析法测出样品中总氮、总磷的真实值,再利用NIRS评估猪粪中总氮、总磷含量,然后利用PLS法,对总氮、总磷的真实值与光谱之间的关系进行分析,建立模型,并使用单次交叉验证技术进行校准.利用2003年春季从不同的农场收集的一组猪粪样本验证了模型的准确性.其评估2003年猪粪样品总氮的相关系数(预测值与真实值之间的相关系数2)为0.86,相对分析误差(RPD)为2.63(RPD主要用于衡量模型计算值的精准度, 2
NIRS技术通过建立模型来检测粪便中的氮磷等成分,耗时短,且不需要对样品进行复杂的前处理过程,可实现多种成分同时检测、在线分析和远程监控,但也具有一定的缺陷.如模型的相关系数仍有待提高;不同地点、不同时间需要建立不同的模型,且需要不断维护更新来确保其准确性;构建一个模型前,常需要大量的样品数据进行支撑.
1.3 电化学分析法
电化学分析法具有操作简单、检测限低等优点,被广泛应用于环境样品中的氮、磷检测.但粪便是一种复杂基质,含有多种背景物质(如无机物、有机物和生物物质等),这些物质的存在会影响电化学分析法的灵敏度和准确性.因此,电化学分析法在粪便样品的氮、磷检测中应用较少.将畜禽粪便样品置于风干盘中,剔除毛发、石块等杂物,经风干、研磨,过筛,得到均匀样品;再对样品消解,提取其中的氮、磷等元素.如通过浓硫酸和过氧化氢消解样品,可将粪便中的大多数有机含氮转化为铵态氮;经过硫酸和过氧化氢消煮,可将有机磷转化成磷酸盐[6];然后再结合电化学检测方法,即可对粪便中氮、磷进行分析检测.
电化学法是基于检测物在电化学反应过程中产生的电流、电阻或电位的变化进行检测,其核心是电极材料和探针的选择,这决定着传感器的稳定性、灵敏度等.电化学法检测环境中的氮,主要是检测NH4+、NO3-、NO2-这3类含氮离子;其中NO3-、NO2-较容易氧化还原转移电子,一般可采用直接检测法,该类物质检测限大部分都已达到μmol/L甚至nmol/L级别.酶、离子载体、络合基团等都是检测这类物质常见的探针[27-29].另外,环糊精,噻唑苯并冠醚乙胺-硫辛酸等都曾被作为离子载体检测NH4+.其中,基于环糊精的伏安法传感器的检测线性范围是4.2~66.0μmol/L[30];而噻唑苯并冠醚乙胺-硫辛酸(TBCEAT)伏安法传感器的检测线性范围是1~105μmol/L[31];纳米铜-聚苯胺纳米复合材料离子印迹聚合物(IIPs)化学传感器[32]检测NO3-的检测限为5μmol/L.贵金属、过渡金属或过渡金属氧化物因其具有较强的催化活性常被用作电极材料或修饰在电极上用于检测含氮物质.有研究表明在铂电极上修饰ZnO检测NO3-的检测限可达到0.018μmol/L[33]; Cu-Ni[34]和Cu-Pd[35]等作电极时,检测限可达到´10-6级.具有较好的导电性及化学稳定性的碳材料及具有良好电子特性的纳米材料也被广泛应用于NO3-、NO2-检测,Chen等[26]构建了基于还原氧化石墨烯(rGO)纳米片的场效应晶体管传感器(图1),使用苄基三乙基氯化铵(TEBAC)作为探针检测NO3-,检测限可达到0.02μmol/L,且检测时间仅需2~7s.此外,也有研究将纳米金属(金纳米颗粒/AuNPs、银纳米颗粒/AgNPs)[36-37]负载在石墨烯表面检测NO2-. Zhao等[38]利用一种射线辐照法制备纳米银功能化石墨烯复合材料检测NO2-,其检测限为0.24μmol/L.
与硝酸盐、亚硝酸盐不同,磷酸盐因很难被氧化,因此其电化学传感检测一般使用间接检测法,即利用磷酸盐的存在影响原体系氧化还原反应中电子的转移从而达到检测目的.如有研究利用双硫脲冠醚作为受体检测,通过H2PO4-与其结合影响亚铁氰化钾的氧化还原反应中电子转移,从而进行检测,其检测限为165μmol/L[39].Cinti等[40]利用铁氰化钾作为电子转移中间体检测磷酸盐,其检测限为4000μmol/L,线性范围为4000~300000μmol/L.He等[41]利用一步水热法合成纳米级水合镍氢氧化物电极检测磷酸盐,在电极灵敏度为210μA×L/ (mmol·cm2)时,其检测限为0.42μmol/L,线性范围10~ 50000μmol/L,响应时间为6s;在电极灵敏度为87μA×L/(mmol·cm2)时,其检测限为0.36μmol/L,线性范围2~5650μmol/L,响应时间为8s. Sun等[42]提出了一种通过无定形磷化钙(CaP)相变时配位羟基的氧化直接检测磷酸盐的电化学方法.该方法在全氟聚合物涂层的玻碳电极上原位形成CaP和磷酸八钙(Ca8(HPO4)2(PO4)4·5H2O)涂层.磷酸盐离子作为质子受体可以促使CaP中的配位水(H2O)生成配位羟基,另外由于Ca2+与H2O的水合作用,会增加配位H2O源.该电极在电压为1.0V处产生明显的氧化峰;该方法检测限可达到0.053μmol/L,线性范围为10~ 1000μmol/L.
图1 场效应晶体管传感器结构示意及其对NO3-离子的动态响应信号
NO3-浓度：0.0028mg/L、0.028mg/L、0.28mg/L、2.8mg/L、28mg/L
表1 氮、磷的检测方法
续表1
注:RPD:相对分析误差; RSD:相对标准偏差.“-”表示无此项,下同.
表1为氮、磷检测方法汇总.标准检测方法的前处理较为复杂,需要使用消解剂或提取剂,耗时长;NIRS样品准备简单,检测速度快,可同时实现多成分检测,但其准确度仍有待提高;电化学法相较于另外两种检测方法,检测限低,可达到μmol/L级别,选择性高,但无法实现多种物质的同时检测且构建方法种类繁多,无统一标准.
2 抗生素检测方法
畜禽粪便中抗生素类物质的常规检测方法主要是高效液相色谱法及液相色谱与其他检测技术联用.电化学分析法和荧光检测法由于其优异的抗生素检测能力,在畜禽粪便中抗生素类物质的检测中具有很大应用潜力.
2.1 液相色谱法
液相色谱以液体为流动相,具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相流入固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析.高效液相色谱法是液相色谱法中的一种,主要是流动相通过高压泵输入色谱柱,其对于复杂基质具有较好的分离效果,并能准确的定性定量分析,因此被广泛应用于粪便中抗生素的检测.目前对于粪便中的抗生素检测主要是依据《有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定高效液相色谱法》(GB/T 32951-2016)[43],其检测限分别为:土霉素750μg/kg、四环素750μg/kg、金霉素1000μg/kg、强力霉素750μg/kg.
利用液相色谱法检测粪便中抗生素的残留量,抗生素的提取是至关重要的步骤,提取剂和提取方法直接关系检测结果的准确性[44].喹诺酮类抗生素样品预处理过程中,需将样品pH值调节至酸性条件,因此提取剂一般使用弱酸性缓冲溶液.另外,喹诺酮类与四环素类抗生素易于与EDTA螯合,使抗生素从基质中脱落,因此提取剂主要以EDTA-Mcllvaine缓冲液为主,其他还包括柠檬酸、乙酸等.夏天骄等[45]以EDTA-Mcllvaine缓冲液作为提取剂检测猪粪样品,回收率为89.7%~96.8%.
粪便中抗生素的提取方法主要包括加速溶剂萃取法、超声萃取法以及震荡提取法.常利用固相萃取法来净化抗生素提取液,并以极性较大的甲醇或极性较小的二氯甲烷、乙酸乙酯作洗脱剂将抗生素从吸附柱上洗脱.李艳霞等[46]利用加速溶剂萃取法提取,并通过固相萃取净化多种抗生素,回收率为58%~101%.罗庆等[47]利用固相萃取法-高效液相色谱检测粪便中的罗红霉素、土霉素、四环素、金霉素的残留量,检测限为60~380μg/kg.
此外,液相色谱法与质谱法(LC-MS)[48-49]、荧光检测法(LC-FLD)[50]或二极管列阵检测法(LC- DAD)[51]联用也是检测粪便中抗生素应用较多的方法.联用技术相对于高效液相色谱法(HPLC),灵敏度更高.王丽等[48]利用HPLC-MS/MS检测猪粪、鸡粪中的四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素,其检测限分别为30.25~7.18, 0.15~3.16和0.04μg/kg.刘博等[52]利用HPLC-FLD检测了北京5个养鸡场中鸡粪样品中6种氟喹诺酮类抗生素,其检出限为2~ 22μg/kg(表2).
表2 抗生素的液相色谱检测法
注:TCs:四环素类;SAs:磺胺类;FQs:氟喹诺酮类;MAs:大环内酯类;OTC:土霉素;TTC:四环素;CTC:金霉素.下同.
2.2 电化学分析法
电化学分析法被广泛应用于多种介质中抗生素的检测,其相较液相色谱法及其联用技术等大型仪器法更加便捷、简单.通过适当的提取剂、提取方法对样品进行处理,并利用固相萃取等方法净化,便可获取粪便中的目标抗生素,从而利用电化学方法进行检测分析.
电化学法中常用的探针主要有酶、适配体以及分子印迹聚合物等.Gonçalves等[53]通过在电极上固定青霉素酶作为探针检测青霉素G,检测限为1.5μg/L.因为酶在高温或酸性碱性等条件下容易失活,对环境条件要求较高,因此基于适配体的传感器被广泛研究.Li等[54]研究了一种基于适配体的丝网印刷碳电极多重电化学方法检测卡那霉素(KAN)和链霉素(STR);其检测原理是KAN和STR能够特异性地与适配体结合,经CdS和PbS标记的适配体互补链被释放,引起电极的电流变化;该方法对卡那霉素和链霉素的检测限分别为0.042和0.026μg/L. Chen等[55]提出了基于适配体/还原氧化石墨烯场效应晶体管传感器,通过适配体与妥布霉素结合后发生构型变化,改变晶体管中导电通道电阻而进行检测,其检测限为0.14µg/L,响应时间约为5s.该课题组还构建了基于互补链脱落原理的适配体/MoS2传感器[56]来检测KAN,其检测限为0.32~ 0.51μg/L,且具有很高的检测特异性和抗干扰性.适配体虽相较于酶具有更强的稳定性,但分子印迹探针稳定性更好,且其能更好的区分结构类似的分子,选择性更高. Jafari等[57]以苯胺为单体,阿奇霉素为模板构建了基于分子印迹聚合物的电化学传感器检测阿奇霉素,该传感器的线性检测范围为0.225~ 689μg/L,检测限为0.075μg/L.Ayankojo等[58]提出了分子印迹聚合物丝网印刷电极检测红霉素,通过对间苯二胺(mPD)的化学聚合,直接在电极上制备了选择性分子印迹聚合物,检测限可达到0.073μg/L,且有较好的选择性.
2.3 荧光检测法
荧光检测法的基本原理是检测物与探针结合后引起荧光信号的减弱或增强,通过荧光信号的变化进行分析检测,其具有较高的选择性和较低的检测限,目前被广泛应用于抗生素分析.根据与抗生素结合的探针类型,荧光法主要可以分为分子印迹型和适配体型[59-60].Yuphintharakun等[61]报道了一种含有羧基化多壁碳纳米管(COOH@MWCNT)和量子点(QDs)的分子印迹聚合物荧光传感器,其检测限为0.066μg/L.此外,作者利用乙腈/三羟甲基氨基甲烷缓冲液作为提取剂,经过搅拌、离心得到鸡肉和牛奶中的环丙沙星提取液,并利用该传感器检测,回收率为82.6%~98.4%.其中,羧酸功能化的多壁碳纳米管可通过π-π作用提高环丙沙星的动力学吸附和结合力;而分子印迹聚合物可提高传感器对环丙沙星的选择性.其工作原理是环丙沙星与分子印迹中功能单体氨基之间可形成氢键,导致QDs导带电子转移到环丙沙星最低未占据分子轨道,引起荧光猝灭. Wang等[62]提出了基于分子印迹荧光传感检测四环素的方法,其利用丙烯基荧光素功能化的二氧化硅微球与分子印迹聚合物形成复合材料,该方法的检测限低至1.9μg/L.
除分子印迹型外,适配体型荧光传感器在抗生素的检测中也得到了广泛研究.Zhao等[63]研究了基于组装在还原氧化石墨烯上的适配体荧光传感器以检测土霉素.土霉素使带有荧光素的适配体从石墨烯上脱落,导致荧光信号变化,其线性检测范围为46~920μg/L,检测限为0.46μg/L.Ramezani等[64]提出了基于外切酶III(Exo III)和金纳米颗粒的卡那霉素荧光传感器.其最大特点是利用Exo III对适配体进行催化回收,以最小的适配体消耗来增强荧光强度,其检测限为0.155μg/L.
表3为抗生素的检测方法汇总,主要包括液相色谱法、电化学法和荧光法.液相色谱法是传统的抗生素检测方法,其对于复杂基质具有较好的分离效果,且可同时检测多种物质,但一般需大型设备,便捷性较差.电化学法和荧光法操作简单、选择性强,且检测限低,但这类方法抗干扰性较弱,且难以实现多种抗生素的同时检测.
表3 抗生素的检测方法
3 结论与展望
3.1 粪便样品的常规检测方法具有准确度高、灵敏度好的特点,但大部分都需要在专业实验室进行或需要使用大型仪器,难以满足原位快速检测或在线监测的需要,因此需要研究粪便中氮磷、抗生素检测的新技术.
3.2 粪便中的氮磷、抗生素等成分可通过前处理方法提取出来,再结合简单、便捷的电化学法、荧光法等对其进行检测.目前电化学法、荧光法等检测技术在其他环境样品中的研究较多,但对粪便样品的检测分析应用较少;因此,电化学法、荧光法在粪便中氮磷、抗生素的快速分析中具有很大应用潜力.电化学法、荧光法的抗干扰性、可重复性以及实现多种物质的同时检测是在粪便分析应用中的研究重点.
3.3 粪便中污染物的高效检测技术在未来的发展空间和需求较大,而将电化学法、荧光法应用于粪便中氮磷、抗生素的检测需要持续深入的基础研究和技术创新.
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Research advances in highly-efficient detection methods for nitrogen, phosphorus and antibiotics in livestock and poultry manure.
HAO Si-bei, LIU Cheng-bin, CHEN Xiao-yan, MAO Shun*
(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China)., 2021,41(4)：1746~1755
In this article, conventional detection methods and emerging detection techniques for nitrogen, phosphorus, and antibiotics in feces have been systematically reviewed to identify the bottlenecks and future research directions. For the conventionalfeces detection methods, they are of high accuracy and sensitivity, but often carried out in professional laboratories or require the use of large instruments. It is quite challenging to meet the need of rapid detection in in-situ or online monitoring situations. Therefore, new detection technologies for nitrogen, phosphorus, and antibiotics in feces are highly needed. Nitrogen, phosphorus, and antibiotics in feces can be extracted by pretreatment, and then be analyzed with simple and convenient electrochemical or fluorescence methods to achieve rapid measures in in-situ analysis or online monitoring settings. Given current technologies, highly efficient detection technologies for pollutants in feces have great potentials and demand in the future. The applications of electrochemical and fluorescence methods in nitrogen, phosphorus, and antibiotics detection in feces need continuous support in fundamental research and technological innovations.
livestock and poultry manure；nitrogen；phosphorus；antibiotic；highly-efficient detection method
X713;O657
A
1000-6923(2021)04-1746-10
郝斯贝(1997-),女,湖南株洲人,同济大学硕士研究生,研究方向为环境分析与传感检测技术.发表论文3篇.
2020-08-31
国家重点研发计划(2018YFC1903201)
* 责任作者, 教授, shunmao@tongji.edu.cn
