青紫颗粒制备工艺及质量控制方法研究

马葆睿，倪健，庞琳诺，蔡梦如，覃柳莹，白杰，张志勤，张萌，王晓玲，曲昌海

（1.北京中医药大学中药学院，北京102488；2.首都医科大学附属北京儿童医院，北京100045)

青紫颗粒以首都医科大学附属北京儿童医院院内制剂青紫合剂为基础，经改剂型而成。该方在临床已实践多年，广泛应用于治疗过敏性紫癜及其合并症，疗效确切[1]。青紫颗粒由青黛、紫草、茵陈、丹参等药味组成，药理试验研究表明青紫颗粒可有效改善因卵蛋白所致过敏性紫癜大鼠炎症反应和肾脏组织病理学损害[2]。青黛、紫草均有抗感染、镇痛的作用[3-4]；丹参有活血、凉血消痈的作用，有研究表明其主要成分丹酚酸B对慢性血清病肾炎大鼠肾脏具有一定的保护作用[5]，茵陈具有清热利湿、利胆退黄的作用，其中绿原酸具有良好的抗炎作用[6]。本研究建立青紫颗粒中丹酚酸B和绿原酸的含量测定方法，并将此方法用于青紫颗粒制备工艺过程的质量控制，并对中试样品中丹酚酸B 和绿原酸含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪、SPD-M20A 检测器（日本岛津公司）；SB-5200DTD 超声波提取器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；MS105DU 分析天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；YP5002电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）。

1.2 药品与试剂

青黛（生产批号：20180328）、紫草（生产批号：20180704）、茵陈（生产批号：20181020）、绵马贯众（生产批号：20171213）、丹参（生产批号：20181006）、白芷（生产批号：20180411）、北寒水石（生产批号：20180407）、威灵仙（生产批号：20180923），以上药材均购自北京本草方源药业有限公司，经北京本草方源药物有限公司研究助理王颖鉴定为正品。丹酚酸B（批号111562-201917，质量分数96.6%）、绿原酸（批号110753-201817，质量分数96.8%）中国食品药品检定研究院提供；3 批青紫颗粒（自制，批号201015、201016、201017）；甲醇、乙腈（色谱醇，Fisher 公司）；纯净水（娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定丹酚酸B与绿原酸的质量分数

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱（0～25 min，7%A；25～26 min，7%A～21%A；26～55 min，21%A；55～56 min，21%A～7%A；56～75 min，7%A）；流速：1 mL/min；检测波长：286 nm（丹酚酸B）和327 nm（绿原酸）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 取丹酚酸B 对照品及绿原酸对照品适量，精密称定，置25 mL 棕色量瓶中，加75%（体积分数，下同）甲醇制成每1 mL 含丹酚酸B 784.39 μg、绿原酸170.37 μg 的母液，取0.5 mL 母液置于10 mL棕色量瓶中，加75%甲醇至刻度，即得每1 mL 含丹酚酸B 39.22 μg、绿原酸8.52 μg 的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 颗粒供试品溶液：取颗粒适量，研成细粉，取约0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声提取30 min（300 W，40 kHz），放冷后称定质量，用75%甲醇溶液补重，滤过，制得颗粒供试品溶液。

提取液供试品溶液：取浸膏粉约1 g，精密称定，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声提取30 min（300 W，40 kHz），放冷后称定质量，用75%甲醇溶液补足损失的质量，滤过，制得浸膏粉供试品溶液。

2.1.4 阴性样品溶液的制备 同法分别自制不含丹参及茵陈的阴性样品，按照“2.1.3”项同法处理制得阴性供试品溶液。

2.1.5 系统适应性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液进样检测，记录色谱图，结果显示供试品溶液色谱图中丹酚酸B 和绿原酸与对照品色谱峰对应的位置上无干扰峰出现，且分离度均大于1.5，理论塔板数大于4 000，表明方法专属性良好，见图1。

2.1.6 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液4、7、10、13、16 μL，进样测定峰面积。以进样量为横坐标（X，μg），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得丹酚酸B 回归方程为Y=10 06494.14X+391.8，r=1.000 0，进样量在0.16～0.63 μg范围内线性关系良好；绿原酸回归方程为Y=2 895 406.89X-880.07，r=1.000 0，进样量在0.03～0.14 μg 范围内线性关系良好。

图1 各成分高效液相色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of each constituent

2.1.7 精密度试验 精密吸取同一份对照品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得丹酚酸B 和绿原酸峰面积RSD 值分别为1.21%、0.35%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验 称取青紫颗粒（批号：201015）约0.5 g，共6 份，按“2.1.3”项方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得丹酚酸B 质量分数为2.96 mg/g，其RSD 值为1.52%；绿原酸质量分数为0.74 mg/g，其RSD值为0.55%。

2.1.9 稳定性试验 取青紫颗粒（批号：201015）供试品溶液，于0、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得丹酚酸B 和绿原酸峰面积RSD值分别为0.67%、1.15%。

2.1.10 加样回收率试验 取已知质量分数（丹酚酸B：2.96 mg/g；绿原酸：0.74 mg/g）的青紫颗粒（批号：201015）0.25 g，精密称定9 份，分3 组，每组3 份，分别按样品中丹酚酸B及绿原酸含有量与相应对照品加入量的比例约为1∶0.8、1∶1、1∶1.2，加入丹酚酸B、绿原酸混合对照品储备液（丹酚酸B：0.740 mg/mL；绿原酸：0.189 mg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率结果见表1和表2。

表1 丹酚酸B加样回收率试验结果(n=9)Table 1 Results of recovery tests of salvianolic acid B

2.2 提取工艺考察

2.2.1 正交试验 以绿原酸及丹酚酸B 提取率为考察指标，选取提取次数（A）、提取时间（B）、加水倍量（C）为影响因素，采用正交设计优选最佳水提工艺。因素水平见表3，试验设计与结果见表4，方差分析结果见表5、表6。根据K 值直观分析表确定最佳工艺为A2B1C3，即加12倍量水，提取2次，每次1 h。

2.2.2 验证试验 按优选工艺A2B1C3进行3 批验证试验，即加12 倍量水，提取2 次，每次1 h，考察工艺稳定性。验证结果见表6，结果表明该提取工艺合理，稳定可行。

2.3 浓缩温度考察

以绿原酸及丹酚酸B 的提取率为考察指标，对水提液的最佳浓缩温度进行考察。按照之前所考察的优选工艺进行提取，分别在60、70、80 ℃下减压浓缩至一定体积（相对密度为1.05～1.10），放冷，加水复溶至原体积后测定绿原酸及丹酚酸B 的含量，计算不同温度下浓缩前后绿原酸、丹酚酸B 的转移率，测定结果见表7，结果表明两种成分几乎没有损失，浓缩温度在80 ℃以下即可。

表2 绿原酸加样回收率试验结果Table 2 Results of recovery tests of chlorogenic acid(n=9)

表3 因素水平表Table 3 Design of factor and level

2.4 干燥温度考察

按优选的提取浓缩工艺得到稠膏，分别在60、70、80 ℃下减压干燥一定的时间，得干浸膏，复溶后进行检测，结果见表8。可见，干燥温度在60～70 ℃时，2 种成分的损失率均在10%以内，损失较少，表明干燥温度在70 ℃以下即可。

2.5 样品含量测定

采用优选得到的提取浓缩干燥工艺参数进行中试放大研究，将浸膏粉∶糊精∶蔗糖以5∶3∶2（质量比）的比例混合均匀，加入0.04%糖精钠为矫味剂，2%聚乙烯吡咯烷酮的95%乙醇溶液为润湿剂进行制粒，并对所得中试样品进行测定。

取3 批青紫颗粒样品（201015、201016、201017）按“2.1.3”项方法制备供试品溶液，并在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，分别计算丹酚酸B、绿原酸2 种成分的质量分数，结果见表9。

表4 水提工艺直观分析表Table 4 Visual analysis table of water extraction process

表5 绿原酸与丹酚酸B提取率方差分析表Table 5 Variance analysis of extraction rate of chlorogenic acid and salvianolic acid B

表6 验证试验结果Table 6 Verification test

表7 浓缩温度考察结果Table 7 Results of concentration temperature（n=3）

表8 干燥温度考察Table 8 Results of drying temperature（n=3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择

在供试品溶液制备时，以青紫颗粒中的丹酚酸B 和绿原酸的提取率为指标，首先对比考察了不同提取溶剂（甲醇、75%甲醇、水）[7-9]，结果显示75%甲醇作为提取溶剂时，2 种检测成分的提取率较佳，且无杂质峰干扰。对不同溶剂倍量（25、50、100、150倍）进行考察，结果显示在溶剂倍量为50 倍时2 种成分已经可以提取完全。最终选择100 倍剂量即50 mL的75%甲醇为溶剂对供试品进行提取。

表9 3批青紫颗粒中丹酚酸B、绿原酸质量分数测定结果Table 9 The contents of salvianolic acid B and chlorogenic acid in three batches of Qingzi granules w/(mg·g-1)

3.2 指标性成分的选择

本试验在保留青紫合剂水提工艺的基础上对指标性成分进行筛选，青黛中靛玉红提取率不足5%，故未选为指标性成分，紫草中有效成分未检出。最终选择君药茵陈中的绿原酸及臣药丹参中的丹酚酸B为指标性成分，结果重复性好，稳定性佳。

3.3 流动相和波长的选择

试验对甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸2 种流动相系统进行考察[10-12]，波长的选择参照2020 年版《中国药典》选择286 nm（丹酚酸B）与327 nm（绿原酸），以青紫颗粒中丹酚酸B 和绿原酸的峰形、分离效果和色谱图中基线平稳、杂质干扰为指标，结果显示乙腈-0.1%磷酸系统效果较佳，最终选择该系统，按照一定的流动相比例作为样品的测定条件。

3.4 提取工艺的选择

由正交试验结果可知，绿原酸提取率的影响因素顺序为A＞C＞B，即提取次数＞加水倍量＞提取时间；丹酚酸B 提取率的影响顺序为A＞B＞C，即提取次数＞提取时间＞加水倍量。方差分析发现，对于绿原酸，提取次数的影响最显著，根据K值直观分析表可发现2 个指标成分的最佳工艺均为A2B1C3，故选择最优提取工艺为A2B1C3，即加12 倍量水，提取2次，每次1 h。由浓缩及干燥温度考察试验结果可知，此两种成分在高温下损失率均不太大，因此将浓缩温度控制在80 ℃以下，干燥温度在70 ℃以下即可，为今后的大规模生产提供了依据。

本研究采用HPLC 梯度洗脱法对青紫颗粒中丹酚酸B 和绿原酸进行了同时测定，建立了青紫颗粒中多指标质量控制模式，所建立的含量测定方法操作简便，专属性强，结果准确，为青紫颗粒质量评价提供了依据。