基于GC-MS 指纹图谱技术结合多元统计分析鉴别不同产地白术的研究

李然，李静，徐长琼，唐奇，夏丽琼，黄妍君，李旭富，黎春辉，童巧珍,5

（1.岳阳市妇幼保健院科研所，湖南岳阳414000；2.岳阳市中医医院药剂科，湖南岳阳414000；3.广州中医药大学中药学院，广东广州510006；4.北京同仁堂平江白术有限公司，湖南岳阳414000；5.湖南中医药大学药学院，湖南长沙410208）

白术药材为菊科植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎，是常用的大宗中药材，又名“于术”“冬术”“浙术”，白术主产于浙江、湖南、安徽、江西、湖北、四川等地，具有健脾益气、燥湿利水、安胎等功效[1]。白术的化学成分主要有挥发油、内酯类、多糖类、苷类、氨基酸等成分[2]。现代药理研究表明，白术具有抗肿瘤、抗感染、调节胃肠功能、抗抑郁、抗老年痴呆等药理活性，其中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和多糖成分具抗肿瘤与抗感染作用，白术挥发油具有调节胃肠、抗抑郁[3-4]、抗癌[5]、修复胃黏膜[6]、抑菌[7]等作用。不同产地因其生境的不同，产出药材所含化学成分各有差异。已有文献报道基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析了浙江、河北、河南、江西等地产白术化学成分的差异[8]，以上方法检出成分多为非挥发性成分，而通过GC-MS 对不同产地白术具多重药效的挥发油进行差异性成分鉴定与分析的研究却鲜有报道。

本文运用水蒸气蒸馏法提取了湖南、安徽、浙江3 个不同产区内所产白术的挥发油，进行GC-MS分析，通过主成分分析、偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析寻找差异性化学成分，并运用NIST 普库检索与文献查对鉴定差异性化学成分，为不同产地白术的鉴别与质量评价提供一定参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

BSA224S-CW 型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；DFT-200 型手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；98-I-B 型电子调温电热套（天津泰斯特仪器有限公司）；挥发油提取器；7890B-5977A 气相色谱-质谱联用仪（安捷伦公司）；无水硫酸钠（广东光华科技股份有限公司，批号：20171120）。

1.2 药物

18 批白术样品分别收集自湖南、安徽与浙江，样品由湖南中医药大学药学院童巧珍教授鉴定为菊科植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎，具体来源情况见表1。

表1 样品来源信息表Table 1 Sample source information

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

取各白术供试品各100 g，用粉碎机粉碎，过二号筛。置1 000 mL 圆底烧瓶中，加水500 mL，浸泡5 h，参照2020 年版《中国药典》“挥发油测定法”提取，所得挥发油加入适量无水硫酸钠充分脱水，分别取各供试品挥发油20 μL，置2 mL棕色量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2 测定条件

色谱条件：色谱柱为HP-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛细管柱，进样量为0.1 μL；分流比为30∶1；气化室温度为250 ℃；载气为高纯度He（99.999%）。程序升温如下：初始柱温为100 ℃，然后以速率3 ℃/min 升至130 ℃，保留10 min，再以速率6 ℃/min升至250 ℃。

质谱条件：EI 离子源；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；接口温度为280 ℃；电离能量为70 eV；EM 电压2 165 V；溶剂延迟3 min；扫描质量范围m/z40～550。

2.3 数据处理与统计分析

将各白术供试品原始色谱图在GC-MS 数据处理工作站积分后进行提取，用中药指纹图谱相似度评价系统的数据格式模板进行预处理，导入中药指纹图谱相似度评价系统，以苍术酮色谱峰进行保留时间的校正，进行峰匹配等，得白术样品各保留时间下色谱峰的匹配结果，将结果整理成二维数据矩阵，包含各样品的保留时间和峰强度等信息。将整理好的数据矩阵导入SIMCA-P 14 软件进行统计分析，首先进行PCA 分析，以便直观分析不同产地白术的分类情况；然后进一步采用PLS-DA 与OPLSDA 分析对不同产地白术样品进行分类，其中判别模型质量好坏的参数为R2Y（该值为模型的解释率）以及Q2（模型的预测能力），R2Y 越接近1，说明模型越稳定，Q2＞0.5 说明模型的预测率较高。根据OPLS-DA 模型的常用变量载荷评价参数VIP（VIP＞1），并结合t-test 的P值（P＜0.05）来寻找差异性成分，再运用NIST 普库检索与文献查对鉴定差异性化学成分。

3 结果

3.1 总离子流图的比较

对不同产地白术挥发油进行GC-MS 分析，总离子流图见图1。结果发现，各产地白术样品挥发油的GC-MS 总离子流图基本相似，经积分并运用峰面积归一化法计算各色谱峰的相对峰面积，发现部分不同产地相同保留时间下色谱峰的相对峰面积有一定差异，说明不同产地白术挥发性成分相似，但含量存在一定差异。

3.2 PCA 分析

从各产区白术挥发油的GC-MS 图谱来看，其挥发油成分具有一定的相似性，难以用常规数据分析方法进行区分。PCA 是多变量识别模式的方法，是一种无监督的多元统计分析技术，可在损失较少数据的前提下利用少量的主成分解释大量变量之间的相关性，进而有效地把多维原始数据降维。将18 个白术样品的匹配数据导入SIMMA-P 14.1 中，进行PCA 分析，PCA 得分图见图2（a），R2X=0.686，Q2=0.342。从图2（a）可看出，不同产地白术样品间未能完全区分，在95%的置信区间内，S1 出现了异常，除湖南产区部分白术样品（S2、S4）未能与浙江与安徽白术样品完全区分外，安徽与浙江产区白术均可被明显区分，说明在GC-MS 数据中存在与产地相关的变量。进一步运用Hotelling T2 检验进一步验证了18 个样本的数据，结果无异常值，见图2（b）。

3.3 PLS-DA分析

图1 不同产地白术挥发油的GC-MS总离子流图Figure 1 GC-MS total ion current diagrams of Volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz in different origins

图2 PCA得分图（a）与Hotelling T2 检验图（b）Figure 2 The PCA score graph(a)and Hotelling T2 test graph(b)

PCA 是一种无监督的分析方法，在确定差异成分时，无法忽略组内差异与随机误差，所以进一步采用PLS-DA 分析方法，该方法为一种有监督模式识别的方法，可用于确定不同产地白术的差异化学成分。图3（a）为不同产地白术PLS-DA 得分散点图，R2X=0.73，R2Y=0.93，Q2=0.719。可见，3 个产地的白术样品被明显区分，表明不同产地白术挥发性化学成分有明显差异。

排列实验是一种外部模型验证方法，主要用于验证PLS-DA 的拟合程度，通过排列试验随机进行200 次改变分类变量y 的排列顺序得到相应不同的随机排列，结果见图3（b）。可见，PLS-DA 模型排列试验中左端随机排列产生的R2和Q2值均小于右端的原始值，表明模型的预测能力大于随机排列y 的预测能力，表示模型有效，可以进行后续的差异性分析[9]。

图3 PLS-DA得分图（a）和200个排列模型验证图（b）Figure 3 The PLS-DA obtained scatter plot(a)and 200 arrangement model verification plot(b)

3.4 OPLS-DA分析

进一步对处理后的GC-MS 数据建立OPLS-DA模型，研究不同产地白术挥发油的差异性并筛选特征差异指标性成分。有监督的OPLS-DA 是一种标准的高维数据分析方法，通过建立预测集和响应集的线性关系对样本进行分类，进而提取样本的特征性差异信息。进行OPLS-DA 分析时，由于预测变量常远大于样本量，容易导致建立的模型发生过度拟合且高估其预测能力，因此需要运用交叉验证判断OPLS-DA 模型效果。验证结果中R2代表模型的拟合度，Q2代表模型的预测能力，R2越接近1，表明模型描述的数据越完整；Q2越接近1，表明模型的预测能力越高。

将处理好的GC-MS 数据导入SIMMA-P 14.1 数据统计分析软件中，建立OPLS-DA 模型，结果显示建立的模型中，当A与B比较时，R2X=0.982、R2Y=1、Q2=0.887；当A 与C 比较时，R2X=0.862、R2Y=0.999、Q2=0.952；当B 与C 比较时，R2X=0.867、R2Y=0.999、Q2=0.974；表明模型可以描述大部分的GC-MS数据，并且具有良好的预测能力。OPLS-DA 得分图散点图见图4（a、c、e），可见各产区白术样本均可以很好地被区分，表明白术挥发油成分在同一产区中具有一定相似性，而不同产区样本之间存在一定差异。进一步运用置换检验评价模型的有效性，进行200次置换检验，结果见图4（b、d、f），所有置换检验的R2和Q2均小于所建立模型的原始值，并且Q2的回归线在Y 轴上的截距为负值，表明所建立的模型没有出现过度拟合，预测能力良好，可以进行后续的差异性分析。

通过色谱峰积分、匹配等，从3 个产地白术供试品挥发油检测结果中共提取了68个成分，各化合物分别编号1～68。为了研究对区分3个产区样本贡献最大的差异性化学成分，运用OPLS-DA 中的SPlot进行分析，距离中心区域越远，代表该成分就是组间分离贡献越大的成分。湖南（A）与安徽（B）、湖南（A）与浙江（C）、安徽（B）与浙江（C）白术的S-Plot分析图见图5（a、c、e）。运用VIP 值描述差异变量的贡献程度，当VIP 值＞1，且经t检验P＜0.05 时，即认为该成分为组间分离贡献率较大的差异化学成分。湖南（A）与安徽（B）、湖南（A）与浙江（C）、安徽（B）与浙江（C）产白术间VIP 得分图见图5（b、d、f）。在湖南（A）与安徽（B）产白术挥发油中共找到19 个差异化学成分（表2），在湖南（A）与浙江（C）白术挥发油中共找到22 个差异化学成分（表3），在安徽（B）与浙江（C）白术挥发油中共找到25 个差异化学成分（表4）。

3.5 不同产地白术差异成分的鉴定

图4 OIPLS-DA得分图（a、c、e）和200次置换检验模型验证图（b、d、f）Figure 4 The OIPLS-DA obtained scatter plots(a,c,e)and 200 permutation test model verification plots(b,d,f)

通过NIST 14 进行匹配与结合文献核查，分别鉴定3个产地两两之间差异性成分。结果表明：（1）湖南（A）与安徽（B）产白术挥发油中的差异成分为苍术酮、β-榄香烯、（1aR）-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氢-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-环丙烷[a]柰、缬草稀醛-4,7(11)二烯等，其中平均相对质量分数大于1.00%的差异性成分有苍术酮、桉油烯醇、3,5,11-洋三烯、巴伦西亚橘烯、β-瑟林烯、香附烯酮；产自安徽的白术含有相对较多的苍术酮、（1aR）-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氢-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-环丙烷[a]萘；其余差异成分的相对质量分数均为湖南产的较安徽产的高。（2）湖南（A）与浙江（C）产白术挥发油中的差异成分有木香醇、(1aR)-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氢-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-环丙烷[a]柰、4(15),5,10(14)-大根香叶三烯-1-醇等，其中平均相对质量分数大于1.00%的差异性成分有β-瑟林烯、香附烯酮、1,5-环癸二烯、1,5-二甲基-8-(1-甲基亚乙基)-(E,E)-，苍术酮则无差异；湖南（A）产白术含有相对较多的(-)-β-榄香烯、1,5-环癸二烯、1,5-二甲基-8-(1-甲基亚乙基)-(E,E)-、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基-环丙基）-环己烯、莎草烯；其余差异成分的相对质量分数均为浙江产的较湖南产的高。（3）安徽（B）与浙江（C）产白术挥发油中的差异成分有环氧化蛇麻烯Ⅱ、4(15),5,10(14)-大根香叶三烯-1-醇、木香醇、(-)-榄香醇等，其中平均相对质量分数大于1.00%的差异性成分有巴伦西亚橘烯、β-瑟林烯、1,5-环癸二烯、1,5-二甲基-8-（1-甲基亚乙基）-(E,E)-、苍术酮、(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基双环[8.1.0]十一烷-2,6-二烯。安徽（B）产白术含有相对较多的1,5-环癸二烯，1,5-二甲基-8-（1-甲基亚乙基）-,(E,E)-、苍术酮、（(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基双环[8.1.0]十一烷-2,6-二烯；其余差异成分均为浙江产白术和相对质量分数较高。

图5 不同产地白术挥发性成分的S-Plot得分图（a、c、e）和VIP值条形图（b、d、f）Figure 5 S-Plot score graphs(a,c,e)and VIP value bar graphs(b,d,f)of the volatile components of Atractylodes macrocephala Koidz.from different origins

4 讨论

中药的质量与其产地密切相关，故寻找有效方法进行产地鉴别，对药材的质量评价意义重大。对于挥发油含量较高且挥发油为其药效的主要有效成分的品种，运用水蒸气蒸馏法提取挥发油、并运用GC-MS 分析鉴定该不同产地药材挥发油成分的差异，该操作简单、快速、专属性强，可有效用于中药质量控制。本研究运用GC-MS 技术，结合多元统计分析对湖南、安徽、浙江产白术的挥发性化学成分的差异性进行分析，通过色谱峰积分、匹配等共提取了68个成分，运用PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 方法进行数据处理，对各产地间差异性化学成分进行了分析。结果表明，基于GC-MS 并结合多元统计分析的方法可有效对不同产地白术进行准确地分类与鉴别，其中有监督的PLS-DA 与OPLS-DA 的分析结果优于无监督的PCA 分析，且在2 个产地间差异成分的分析与鉴别中，OPLS-DA的效果最优。

化学成分差异性分析结果表明，在湖南与安徽产白术之间，安徽产的白术含有相对较多的苍术酮、（1aR）-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氢-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-环丙烷[a]萘；在湖南与浙江产白术之间，《中国药典》中白术的质量指标性成分苍术酮则无差异，湖南产白术含有相对较多的(-)-β-榄香烯、1,5-环癸二烯、1,5-二甲基-8-(1-甲基亚乙基)-(E,E)-、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基-环丙基）-环己烯、莎草烯；安徽与浙江产白术相比，安徽产白术含有相对较多的1,5-环癸二烯、1,5-二甲基-8-（1-甲基亚乙基）-(E,E)-、苍术酮、（(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基双环[8.1.0]

十一烷-2,6-二烯。综上可见，基于GC-MS 分析并结合多元统计分析的方法，可以对白术进行很好的产地鉴别。

表2 湖南（A）与安徽（B）白术挥发油差异化学成分Table 2 The difference chemical compositions of volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz.Produced in Hunan(A)and Anhui(B) (P＜0.05,n=6）

表3 湖南（A）与浙江（C）白术挥发油差异化学成分Table 3 The difference chemical compositions of volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz.Produced in Hunan (A) and Zhejiang(C) (P＜0.05,n=6）

表4 安徽（B）与浙江（C）白术挥发油差异化学成分表Table 4 The difference chemical compositions of volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz.Produced in Anhui (B) and Zhejiang(C)(P＜0.05,n=6）