低度黑莓果酒发酵菌株筛选与工艺优化

韦梦婷 王英 刘小莉

摘要：检测酿酒酵母FM-S-115、FY4和Lmb-1的耐糖、耐乙醇和耐SO2特性，再接种到黑莓汁中观察实际发酵效果，综合对比丹麦生物科技公司的商业发酵剂酵母RHYTHM.nsac，筛选出1株性能更优良的菌株FM-S-115。以加糖量、酵母添加量和发酵温度3个因素优化发酵条件，考察主要营养成分和感官品质的变化，得出最适发酵工艺。结果表明，FM-S-115为最适发酵菌种，加糖量8%、接种量7.0%，20 ℃是最适发酵温度，该条件下发酵的果酒口感协调、色泽鲜艳、乙醇度适宜。

关键词：低度黑莓果酒;酿酒酵母;发酵工艺

黑莓为蔷薇科悬钩子属灌木，果实饱满，丰富多汁，色泽宜人，香味浓郁，富含多种色素、有机酸和维生素以及多种矿物质元素[1]。江苏省中国科学院植物研究所于20世纪80年代从美国引入黑莓，通过数十年来的选育与试种，已基本掌握其生长、结果习性，目前在江苏省南京市溧水区有较大的种植面积[2]。黑莓皮薄汁多，采摘之后不易保藏，加工成果酒是其产业发展的一个主要方向。

黑莓果酒是随着黑莓的种植逐渐兴起的新型食品，在原料的基础之上，不仅富含多酚类物质，而且有着比其他果酒更有效的体外抗氧化的功效[3]。此外，黑莓中丰富的花青素也可预防心血管病，有效改善血管健康状况，减少动脉粥样硬化，预防冠心病和中风并降低患病风险[4]。低度果酒是乙醇含量比普通果酒低（体积分数为1.0%～8.0%），而营养成分基本不变的一类新型果酒[5]，不仅符合中国居民膳食指南推荐的健康饮食习惯，也可供更多种类人群食用，如青少年、老人等，是酒类研究的热点方向。本试验以酿酒酵母FM-S-115、FY4和Lmb-1为发酵菌种，首先检测该3株菌株的耐糖、耐乙醇和耐SO2的特性，再发酵黑莓汁，测量发酵前后残糖量、总酚含量、花色苷含量、单宁含量、乙醇度和颜色6个理化指标的變化，与科汉森（中国）有限公司的商业发酵剂酿酒酵母RHYTHM.nsac对比，以筛选出品质能与RHYTHM.nsac相当或者更优的菌株。使用该菌株发酵黑莓汁，以加糖量、酵母添加量和发酵温度3个因素优化发酵工艺，测量果酒感官品质，选择感官品质最好的为最适发酵工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验原料 黑莓冻果（-18 ℃贮藏）（南京双吉农业发展有限公司）;酿酒酵母FM-S-115、FY4和Lmb-1，保存于江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程研究室;商业发酵剂RHYTHM.nsac[科汉森（中国）有限公司]。

1.1.2 主要试剂 马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB，北京奥博星生物技术有限责任公司）;白砂糖（食品级，苏果超市有限公司）;果胶酶（食品级，宁夏夏盛实业集团有限公司）;偏重亚硫酸钾（食品级，上海杰兔工贸有限公司）。

1.2 仪器与设备

UV-1600PC紫外分光光度计（上海美普达仪器有限公司）;SW-CJ-1C双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）;LHS-80HC-Ⅰ生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;YS6060台式分光测色仪（深圳三恩时科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验时间和地点 本试验于2019年5—7月在江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程研究室完成。

1.3.2 黑莓果酒的制作工艺 冷冻黑莓果→解冻→打浆→调配（加白砂糖、果胶酶和焦亚硫酸钾）→接种→发酵→原酒。

1.3.3 最佳酿酒酵母的筛选 通过测定酵母的耐糖、耐乙醇和耐SO2性能来筛选菌株。以PDB为基础培养基，分别改变糖含量为2.0%、10.0%、140%、16.0%、18.0%和22.0%，改变乙醇含量为2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%和12.0%，改变SO2浓度为300、400、500、600、700 mg/L，每组试验1个变量，其他条件保持一致，将预先活化好的菌液（菌体浓度为1.01×108～1.11×108 CFU/mL）以3%的接种量接入培养液中，28 ℃、150 r/min，培养16 h，3组平行试验，测定菌体稀释5倍下菌液的D600 nm。

检测实际发酵中4株酵母性能。将4株菌以5%的接种量接种到黑莓汁中，观察其发酵时间，发酵结束时的残糖量、总酚含量、花色苷含量、单宁含量、色差和整体感官品质。将FM-S-115、FY4与Lmb-1和商业发酵剂RHYTHM.nsac 为参照，选出最合适的发酵菌种。

1.3.4 低度黑莓果酒发酵工艺的单因素试验 以加糖量、酵母添加量和发酵温度3个因素优化发酵工艺。加糖量直接决定果酒的乙醇度，纯黑莓汁的糖含量为110 g/L，选择加糖量为0.0、4.0%和80% 3个梯度;酵母添加量选择3.0%、5.0%、70%、9.0% 4个梯度;发酵温度选择20、25、30 ℃ 3个梯度。每组试验1个变量，其他条件须一致。每组试验重复3次，残糖量4 g/L以下即为发酵结束，测量各指标的变化。

1.3.5 低度黑莓果酒发酵工艺优化的正交试验 单因素试验确定加糖量、酵母添加量和培养温度3个因素3个水平，借助正交设计助手Ⅱ软件，确定最适合低度黑莓果酒酿造的条件。正交试验的因素和水平设计见表1。

1.3.6 各指标的检测方法 残糖量测定使用苯酚硫酸法，具体步骤见参考文献[6]。

总酚含量测定用Folin-酚试剂法，具体步骤见参考文献[7]。

花色苷含量测定使用pH值示差法，具体步骤见参考文献[8]。

单宁含量测定采用甲基纤维素沉淀法。（1）标准曲线的制作。以表儿茶素水溶液计，分别测浓度为0、10、25、50、75、100、150、200 mg/L的表儿茶素水溶液在280 nm下的吸光度，以表儿茶素水溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程y=0.009 81x+0.028 8，r2=0996 1。（2）样品的单宁含量测定。2支试管，各取样 200 μL，分别加入2 400 μL蒸馏水（对照组）和004%甲基纤维素（处理组），摇匀静置3 min，各加1 600 μL饱和硫酸铵溶液，定容至8 mL。摇匀静置10 min，离心10 min，转速1 000 r/min，取上清液，测2支试管的D280 nm。

D280 nm（单宁）=D280 nm（对照组）-D280 nm（处理组）。（1）

乙醇度的测定采用蒸馏法，具体步骤见参考文献[8]。

色差的检测方法。采用CIELab颜色参数[9]测定果酒的颜色。参考该方法使用色差仪测出参数L*（亮度）、a*（红绿）和b*（黄蓝）。总色差（ΔE*）是用来描述2组颜色整体对比差异的参数。

感官评定。根据 GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官分析法[10]，分别从色泽、澄清度、香气、滋味及典型性对黑莓果酒进行感官评定（表2）。

2 结果与分析

2.1 4株酵母的耐糖性能测定

果酒酿造，须适量添加果胶酶、葡萄糖和SO2，以助充分发酵和抑菌，酿酒酵母须对这3种物质具有一定的耐性。由图1看出，在10.0%～14.0%的添加量内，所有菌株生长良好;大于14.0%时，生长量开始下降，与刘畅等试验得出在糖含量10.0%之后就开始下降[11]相比，本试验的4株菌株耐糖性更高。虽总体趋势相似，菌株之间各有不同，FM-S-115和RHYTHM.nsac的生长量始终高于FY4和Lmb-1，且前者最适生长浓度更高。

2.2 4株酵母的耐乙醇性能测定

由图2可知，乙醇对酵母有抑制作用。在浓度为0.0～6.0%内，所有菌株均能保持较高的生长密度;6.0%～8.0%时开始下降，FY4和Lmb-1菌体密度下降速度缓慢，FM-S-115和RHYTHM. nsac下降迅速;乙醇浓度大于8.0%时，所有菌株的生长被严重抑制;12.0%时，除了Lmb-1的D600 nm值还能保持在0.5左右，其他菌株均接近于0，基本停止生長，可见Lmb-1相比其他几株菌更耐乙醇，在酿造高度酒上具有很大优势。与李铮等的试验结果得出的乙醇耐受性达到16.0%[12]相比，本试验4株酵母耐受性较低，还有待驯化提高。然而在酿造低度果酒上，4株菌均能够成为优势菌，完成发酵进程。

2.3 4株酵母的耐SO2性能测定

由图3可知，在300 mg/L以内，4株菌均有较高的耐受性;大于300 mg/L时，菌体密度下降明显，但D600 nm值仍保持相对较高，在0.9左右。可见，相比于吴启凤等研究得出仅有1株菌能在300 mg/L浓度下存活的结果[13]来说，试验中4株菌均有较高的耐SO2性。虽FY4和Lmb-1的耐性略低于其他2株菌，在酿酒所需浓度内，4株菌均能满足发酵要求。

2.4 4株酵母的黑莓果酒发酵性能测定

在有氧的条件下，酵母通过呼吸作用将黑莓汁中的白砂糖转化为乙醇和其他副产物，有些为有益副产物，赋予果酒独特的芳香风味，少量为有害产物，抑制酵母生长，所以菌种不同，发酵产酒的风味和口感各异[14]。由表3可知，4株菌中FM-S-115和RHYTHM.nsac感官品质最好，作为1株较为成熟的发酵菌株，RHYTHM.nsac各活性物质均损失较少，FM-S-115与之相比，各指标大致相同，且FM-S-115发酵结束所需时间更短，发酵速度更快，这一点在实际生产中意义重大。

综合耐糖、耐乙醇和耐SO2性能和菌株发酵黑莓果酒品质分析的结果，菌株FM-S-115 的耐糖、耐乙醇和耐SO2性最好，发酵过程对黑莓中的活性物质损失最小且乙醇度较高。和性能成熟的商业发酵剂RHYTHM. nsac相比，FM-S-115各方面性能与其接近，且发酵时间更短，因此选择FM-S-115为低度黑莓果酒的最佳发酵菌种。

2.5 低度黑莓果酒发酵工艺优化的单因素试验

2.5.1 加糖量对果酒发酵的影响 由表4可以看出，加糖量越高， 发酵时间越长，乙醇度和总色差的变化明显，未加糖处理组的初始总糖含量为118613 g/L，发酵时间短，结束时乙醇含量低，黑莓的酸味略重，酒香上略有欠缺;4.0%加糖量处理组的初始总糖含量为 222.613 g/L，发酵结束活性物质花色苷、单宁损失较多，且感官品质略差;8.0%的加糖量处理组的初始糖含量为286.347 g/L，发酵结束时乙醇度达到7.5%，含量适中，但总色差变化较明显，色泽损失较多。整体感观上，8.0%的加糖量的感观评分最高，果酒澄清透明，有光泽，香气纯正、优雅，酒体丰满、醇厚协调，黑莓的酸味和酒体的香味融合较好，且乙醇度相对较低，符合市场需求，因此8.0%是最合适的加糖量。

2.5.2 酵母添加量对果酒发酵的影响 由表5可知，酵母添加量对各个指标均有不同程度的影响。酵母添加量为3.0%和5.0%时，发酵时间略长;接种量为7.0%时，发酵时间最短，总酚、花色苷和单宁保留量最多，且感官评分最高;随着接种量的继续增大，感官评分开始下降，可能原因是接种量过大导致营养物质一部分被用于酵母的增殖，而用于无氧呼吸发酵的减少，乙醇含量降低[15]，且营养物质大量消耗和有害代谢产物积累，使发酵环境变差，从而导致菌体过早衰老自溶[16]。因此，试验中选择7.0%为最适酵母添加量。

2.5.3 温度对果酒发酵的影响 由表6可以看出，随着发酵温度的升高，酵母活性提高，发酵时间缩短，感官评分逐渐降低，在20 ℃时口感最好。温度过低，发酵时间长，易发酵不彻底;温度过高会使酵母活动加剧，导致酵母过早老化死亡，同时伴随一些高级醇等副产物的产生，影响果酒的风味和品质[17]，因此选择20 ℃为最适发酵温度。

2.6 低度黑莓果酒发酵工艺优化的正交试验

本研究选择加糖量、酵母添加量、发酵温度3个变量因素作为低度黑莓果酒品质的影响因素。以感官评分为考察指标，按照表1进行试验，试验结果见表7。由表7可知，3个因素对黑莓果酒的感官评分的影响大小依次为发酵温度、加糖量和酵母添加量，最佳组合为A2B2C2，即发酵温度为20 ℃，加糖量8%，接种量为7%。由表8可知，发酵温度、加糖量、酵母添加量对黑莓果酒感官评分影响都显著（P<0.05）。