钩吻素子抗糖尿病大鼠神经病理性疼痛的作用及其与脊髓别孕烯醇酮的关系

黄慧慧，陈火树，钟志凤，许 盈，俞昌喜

糖尿病性神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是神经病理性疼痛的重要类型之一，也是糖尿病最常见的并发症[1-2]。DNP是一种较为复杂的慢性疼痛状态，使患者的生活质量受到显著影响。目前治疗DNP主要采用药物治疗，但临床上常用的治疗药物疗效不佳或有严重的毒副反应。因此，亟待开发安全且有效的新型抗DNP药物。

钩吻素子(koumine, KM)是胡蔓藤属植物钩吻(GelsemiumelegansBenth.)中含量较高的一种单萜吲哚类生物碱单体[3]。研究显示，钩吻素子对慢性疼痛有良好的治疗作用，且毒性较低，但其机制有待于进一步研究[4-5]。本研究拟采用链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导建立1型DNP大鼠模型，以机械刺激缩足阈(mechanical withdrawal threshold，MWT)为指标，观察连续多次钩吻素子灌胃对DNP的镇痛作用，观察该作用与脊髓别孕烯醇酮(allopregnanolone，AP)水平的关系，以期为钩吻素子的新药研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 48只体质量180～200 g雄性SD大鼠，SPF级[北京市维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001]。实验前适应性喂养1周，自由摄水摄食，所有操作均遵守国际及本地伦理委员会颁布的条例。

1.1.2试剂 钩吻素子粉末(由福建医科大学神经药理课题组提供，实验室制备批号KM201309)，纯度99%；加巴喷丁(上海信合化工有限公司)，纯度99%；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；STZ(美国Sigma公司)；AP ELISA试剂盒(美国Arbor assays公司)。

1.1.3仪器 Electronic Von Frey机械测痛仪(2390型，加拿大IITC Life Science公司)；精密电子天平(日本AND会社)；酶标仪(Epoch型，美国 BioTek 公司)；血糖仪(ONE-TOUCH 型，美国强生医疗器材有限公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠MWT测定 参照文献[6]，大鼠预适应仪器30 min，待安静时，用Von Frey纤维丝刺激动物后足底部中间部位，大鼠出现突然缩足、抖足或添足，记为有效缩足反应，记录此时的刺激强度。重复测定3次，相邻两次测定间隔5 min，以3次测试的平均值记为该只大鼠的MWT。

1.2.2DNP模型的建立 参照文献[7]建立DNP大鼠模型。大鼠禁食12 h，不禁水。STZ以柠檬酸缓冲液临用现配成1%浓度，按70 mg/kg剂量迅速腹腔注射给药。STZ处理当天记为第0天。STZ处理后第3天测定血糖水平，筛选出血糖达标的大鼠(血糖值≥16.7 mmol/L[7]，提示糖尿病模型建立成功)，淘汰血糖不达标的大鼠(<16.7 mmol/L，糖尿病模型建立失败)。STZ处理前测量大鼠MWT值，连测3 d，以第3天的MWT值记为该大鼠的基础痛阈值。测量STZ处理后第21天的MWT，若第21天的MWT值与基础痛阈值之比<0.8，认为成功制备DNP模型；反之，则该动物退出实验。

1.2.3分组及给药 48只SD大鼠根据基础痛阈值随机分为对照组(n=6)及STZ处理组(n=42)。STZ处理后第3天测血糖，42只STZ大鼠中有 6只血糖低于16.7 mmol/L退出实验，36只建成糖尿病模型。第21天测MWT，计算MWT与基础痛阈的比值，36只糖尿病大鼠中有5只比值>0.8退出实验，成功建立为DNP模型的动物进一步随机分成5组：模型组、加巴喷丁100 mg/kg剂量组及钩吻素子0.28，1.4，7.0 mg/kg剂量组。自STZ处理后第22天起，每天灌胃给予对应药物，其中对照组和模型组给予等体积溶剂，每天1次，持续8 d。分别在STZ注射前和注射后第21，22，24，26及28天给药1 h后测定MWT，在STZ注射前和注射后第21，23，25，27及29天称量大鼠体质量，观察钩吻素子对DNP模型大鼠疼痛与体质量的影响。

1.2.4ELISA检测AP水平 观测钩吻素子对DNP模型大鼠疼痛和体质量影响结束后，异氟烷麻醉大鼠，快速取L4～L6段脊髓。每100 mg脊髓样本添加含苯甲基磺酰氟的PBS 1 mL，冰上裂解，制备匀浆，低温离心30 min，取上清液，BCA试剂盒检测各组蛋白浓度。根据ELISA试剂盒操作测定各样本AP水平。

2 结 果

2.1钩吻素子对DNP大鼠体质量的影响 对照组大鼠体质量稳步增加(图1)，毛色亮泽，活动自如。STZ处理大鼠则表现出饮水次数明显增加、多尿、消瘦、毛色暗黄、易掉毛、活动度差等现象。体质量数据经重复测量方差分析显示，分组因素、时间因素和交互作用均有统计学意义(P<0.001)。分组因素进一步组间两两比较分析，显示对照组体质量与模型组差别有统计学意义(P<0.001)；其他各组与模型组比较，差别均无统计学意义(P>0.05)，说明钩吻素子与加巴喷丁对DNP大鼠的体质量均无改善作用。

DNP：糖尿病神经病理性疼痛;STZ：链脲佐菌素；KM：钩吻素子；GBP：加巴喷丁。与对照组比较，###：P<0.001。

2.2钩吻素子对DNP大鼠MWT的影响 MWT数据经重复测量方差分析显示，分组因素、时间因素和交互作用均有统计学意义(P<0.001)。分组因素进一步组间两两比较分析显示，模型组与对照组大鼠的MWT差别有统计学意义(P<0.001)，钩吻素子各处理组和加巴喷丁处理组与模型组大鼠的MWT差别均有统计学意义(P<0.001)，但钩吻素子处理组与加巴喷丁处理组MWT差别无统计学意义(P>0.05)。分别对各时间点MWT数据进行单因素方差分析(图2)，STZ处理组在STZ处理后第21天的MWT下降50%，模型组在实验全过程保持低MWT水平(即持续的痛敏状态)，与对照组比较，差别具有统计学意义(P<0.001)；钩吻素子1.4，7.0 mg/kg 组和加巴喷丁处理组自第1次给药起MWT值较模型组高，差别具有统计学意义(P<0.001)。钩吻素子具有改善DNP大鼠机械痛敏的作用，呈时间和剂量依赖性(P<0.001)。

DNP：糖尿病神经病理性疼痛;MWT：机械刺激缩足阈；STZ：链脲佐菌素；KM：钩吻素子；GBP：加巴喷丁。与对照组比较，##：P<0.01，###：P<0.001；与模型组比较，☆☆☆：P<0.01；与加巴喷丁组比较，△：P<0.05，△△△：P<0.001。

2.3钩吻素子对DNP大鼠脊髓AP水平的影响 对照组与模型组大鼠脊髓AP水平差别无统计学意义(P>0.05,图3)。与模型组比较，钩吻素子处理组大鼠脊髓AP水平升高，其中钩吻素子1.4，7.0 mg/kg 处理组与模型组差别有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。经单因素方差分析显示，模型组和钩吻素子处理组AP组间比较，差别有统计学意义(P<0.01)，提示钩吻素子对AP水平的增高作用具剂量依赖性。模型组和钩吻素子处理组末次MWT数据和AP数据进行相关分析，结果显示，DNP大鼠MWT与脊髓AP水平呈中度正相关，相关系数为0.486(P<0.05)。

DNP：糖尿病神经病理性疼痛;AP：别孕烯醇酮；STZ：链脲佐菌素；KM：钩吻素子；NS：生理盐水。与模型组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01。

3 讨 论

STZ诱导的DNP模型是应用最广泛的动物研究模型[8]。STZ是提取自链霉菌属的抗生素，可干扰葡萄糖的转运，特异性损伤胰岛β细胞[9]，促进糖尿病的发生发展，进一步引起神经系统病变产生DNP，其操作简便且成模率高[10]。本研究经STZ给药第3天后，大鼠的血糖值即升高至16.7 mmol/L以上。随着实验进展，STZ给药组血糖持续上升，远高于对照组；实验过程中，STZ处理的模型组大鼠出现多饮、多尿、体质量降低、极其消瘦等糖尿病特征；STZ处理后第21天，模型组大鼠痛阈下降一半，出现痛敏并持续到实验结束，与文献报道相似[10]，提示DNP模型建立成功。在此基础上，给予钩吻素子灌胃对DNP大鼠有改善痛敏的作用，且效应具有时间及剂量依赖性。钩吻素子灌胃给药途径对1型糖尿病大鼠DNP的治疗效果与前期皮下注射给药途径的治疗效果类似[11]。钩吻素子不仅对1型糖尿病大鼠DNP有治疗作用，对自发肥胖型2型糖尿病ZDF大鼠的DNP亦有改善作用。除了改善DNP，钩吻素子还能改善糖尿病大鼠的神经病变症状[11]，提示钩吻素子具有治疗糖尿病并发症的潜在应用价值。

DNP的病理生理机制十分复杂，有待于进一步探究。神经活性甾体在慢性疼痛中的作用日益受到重视。脊髓部位可合成神经活性甾体，某些神经活性甾体涉及外周NP的调控[12-15]。内源性的AP可别构调节激动 GABAA受体产生抑制性作用，而后者在疼痛调节中发挥着重要作用[12-13]。AP能有效治疗肿瘤药物引起的NP[14]。Meyer等[15]的研究指出，3α-羟类固醇脱氢酶是神经活性甾体AP合成过程的最后一步，调节其活性可对外周神经损伤大鼠产生显著的镇痛作用；升高AP水平可明显改善NP大鼠的机械痛敏状态；口服AP类似物对NP患者具有良好的治疗作用[16]。由此可见，脊髓AP可能是DNP的重要调控分子，上调脊髓AP水平可产生镇痛作用，AP有望成为研制新型抗DNP药物的潜在效应分子。笔者课题组前期亦在大鼠坐骨神经慢性束缚损伤和大鼠坐骨神经分支选择性损伤疼痛模型上观察到钩吻素子在抑制疼痛模型大鼠机械痛觉的同时，还能提高其腰段脊髓的AP水平[5,17-18]；钩吻素子可通过促进CCI大鼠腰段脊髓3α-羟类固醇脱氢酶mRNA表达从而提高3α-羟类固醇脱氢酶蛋白的水平[5]；同时，钩吻素子连续皮下注射给药可显著增强CCI大鼠脊髓3α-羟类固醇脱氢酶活性[5]。3α-羟类固醇脱氢酶能催化AP的合成，从而激动GABAA受体发挥镇痛功能[19]。综上，AP很可能是钩吻素子发挥镇痛作用的效应分子。本研究在1型DNP模型中发现，模型组AP水平与对照组比较有降低趋势，但差别无统计学意义，可能是糖尿病诱发的大鼠代谢率下降、消瘦有关；给予钩吻素子治疗后，DNP大鼠脊髓AP水平显著升高且呈剂量依赖性，与大鼠末次MWT呈中度正相关，提示钩吻素子改善DNP作用可能与其上调脊髓AP水平有关，有待进一步确证研究。