四种石斛花化学成分及抗氧化活性

李崇萍， 刘倩葶， 刘琨毅,3， 梁正维， 刘明丽， 张正艳， 程建胜，赵菊润， 安江珊， 李红叶， 张新凤， 赵 明*

(1.云南农业大学龙润普洱茶学院， 昆明 650201； 2.云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室/西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心， 昆明 650201； 3.云南农业大学食品科学技术学院， 昆明 650201； 4.云南品斛堂生物科技有限公司， 德宏 678300； 5.龙陵县石斛研究所， 德宏 678300； 6.浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室， 杭州 311300)

石斛属(DendrobiumSw.)为兰科(Orchidaceae)植物中的第二大属，广泛分布于亚洲热带和亚热带地区[1]。在全世界有1 400多种，目前中国已记载石斛属植物81种，2变种，其中18种为中国特有种[1]。中医认为，石斛具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效；现代药理研究认为石斛具有增强免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血压等功效[2-3]。《中国药典》(2020版)收载铁皮石斛与石斛两个药材，前者指铁皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)的茎，是传统名贵药材[4]；后者包括金钗石斛(D.nobile Lindl)、鼓槌石斛(D.chrysotoxumLindl.)或流苏石斛(D. fimbriatum Hook.)及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎[5]。紫皮石斛(D.devonianumPaxt)是一种多糖含量较高，集药用、保健、食用和观赏为一体的石斛[6]。梳唇石斛(D.strongylanthumRchb. f.)主要分布于云南景洪、勐海，是中国一级珍稀濒危药用石斛原植物之一[7-9]。

随着组培技术的发展，石斛已经广泛被人工种植。目前大面积种植的石斛，主要是铁皮石斛、霍山石斛、紫皮石斛，除此之外鼓槌石斛及梳唇石斛也有部分种植。云南是中国石斛种植面积最大的省份，其种植面积多达8万亩(1亩=666.67 m2)，全国70%的石斛出自云南[10]。截止到2018年，全国铁皮石斛种植面积达8万余亩，其中云南铁皮石斛种植面积已达5万亩，占全国铁皮石斛种植面积的49.7%[11]。云南省龙陵县是“紫皮石斛之乡”，2018年，全县紫皮石斛种植面积2.02万亩，占全国种植和产量的70%以上[12]，云南鼓槌石斛人工栽培面积达已达1万亩，年产鲜花1 198.21 t，实现产值2 396.4万元；产鲜茎13 309.7 t，实现产值15 962.4万元[13]。在石斛种植过程，产生了大量的石斛花，不仅具有观赏价值，而且具有重要的开发价值。2018年6月，中华人民共和国国家卫生健康委员会卫健委发布通告铁皮石斛花作为新食品原料终止审查，按照地方特色食品进行管理[14]。2020年6月，浙江省卫生健康委员会发布关于《浙江省食品安全地方标准 干制铁皮石斛花》(DB33/ 3011—2020)的通告[15]。2020年6月，广西壮族自治区卫生健康委员会发布《铁皮石斛花》(DBS45/ 062—2019)食品安全地方标准[16]。2020年7月，福建省卫生健康委员会关于发布《福建省食品安全地方标准 铁皮石斛花》(DBS35/ 001—2020)的通告[17]。2020年7月，贵州省卫生健康委员会发布《食品安全地方标准铁皮石斛花(干叶)》(DBS52/ 045—2020)[18]。2018年2月，《云南省食品安全地方标准 紫皮石斛》(DBS 53/027—2018)开始实施[19]。由此可见，更多石斛花的品种即将纳入食品管理行列，其物质组成、生物活性以及产品开发利用将成为一个新的研究热点。

关于石斛花的化学成分与生物活性，已经有部分报道，如：李芳等[20]研究发现铁皮石斛花具有良好的抗氧化活性；吕素华等[21]研究表明铁皮石斛花中含有较为丰富的多糖、浸出物及氨基酸等营养成分；雷珊珊等[22]研究表明铁皮石斛花能改善阴虚、改善肝功能损伤；杨晓娜等[23]研究表明紫皮石斛花色苷色素具有良好的抑菌及自由基清除能力；Deng等[24]认为紫皮石斛花茎中含有大量具有免疫调节活性的多糖类物质；鼓槌石斛花中含有的菲类、联苄类、芴酮类、酯类、甾体、维生素等物质，故其具有抗肿瘤活性、抗HIV活性、抗氧化活性和滋阴作用[25]，石斛花含有多糖、氨基酸、类黄酮、甾体、维生素等物质，具有抗氧化等、滋阴、免疫调节等活性。并且不同种类的石斛花外观与物质组成，乃至生物活性都不同，有必要比较研究。

铁皮、紫皮与鼓槌石斛在云南已经大面积种植，随之也产生了大量的石斛花。梳唇石斛在云南零星种植，也有一定量的石斛花。随着栽培面积的逐年扩大，产生了大量的石斛花，亟须对其产品进行深度研发，以促进云南石斛产业的良性发展。生物医药成为云南医药产业最具活力，最具成长性的产业，且未来前景乐观[26-27]。研究4种石斛花的物质组成与生物活性，不仅具有重要的经济价值，也具有一定的科学意义。为此，现以铁皮石斛花、紫皮石斛花、鼓槌石斛花与梳唇石斛花为材料，测定比较化学成分及抗氧化活性，旨在为不同种类石斛花的开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

铁皮石斛花(D.officinaleKimura et Migo’s flower，DOF)、紫皮石斛花(D.devonianumPaxt’s flower， DDF)、鼓槌石斛花(D.chrysotoxumLindl’s flower，DCF)、梳唇石斛花(D.strongylanthumRchb. f. ’s flower， DSF)于2018年5月采自云南品斛堂生物科技有限公司云南龙陵石斛种植基地(图1)，采摘后40 ℃烘干，粉碎后过40目，待用。总抗氧化(total anti-oxidation competence，T-AOC)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基和羟自由基(·OH)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。杨梅素(myricetin, My)、槲皮素(quercetin，Qu)、木犀草素(luteolin，Lu)、山奈酚(kaempfero，Kf)、花旗松素(taxifolin，Tax)和芦丁(rutin，Ru)标准品均购自天津一方科技有限公司；天冬氨酸(aspartic acid，Asp)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、丝氨酸(serine，Ser)、组氨酸(histidine，His)、甘氨酸(glycine，Gly)、苏氨酸(L-threonine，Thr)、精氨酸(L-arginine，Arg)、丙氨酸(alanine，Ala)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)、半胱氨酸[L(+)-cysteine，Cys]、甲硫氨酸(methionine，Met)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、异亮氨酸(isoleucine，Ile)、亮氨酸(leucine，Leu)、赖氨酸(lysine，Lys)、缬氨酸(valine，Val)、脯氨酸(proline，Pro)标准品购自美国Agilent公司；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)均购于美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

图1 4种石斛花样品Fig.1 Four kinds of Dendrobium’s flower

1.2 仪器与设备

CP214型电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；HB10型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂； SHB-III型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；HH-S28S型数显恒温水浴锅，金坛市大地自动化仪器厂；756CRT 型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；1200型高速液相色谱系统，美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 理化指标测定

应用酒石酸亚铁比色法[28]、茚三酮比色法[28]、苯酚-硫酸法[28]和蒽酮比色法[28]分别测定4种石斛花的多酚(polyphenols，PP)、游离氨基酸(free amino acid，FAA)、多糖(polysaccharide，PS)和可溶性糖(soluble sugar，SS)含量。

1.3.2 功能性成分测定

按照实验室前期建立的方法，应用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定氨基酸组分(Ala、Arg、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Val)，并根据峰面积使用外标法进行定量分析[29]。应用实验室前期建立的HPLC方法测定类黄酮物质(My、Qu、Lu、Kf、Tax、Ru)，并根据峰面积使用外标法进行定量分析[30]。

1.3.3 抗氧化活性测定

4种石斛花待测液的制备：在10 g石斛花粉末加入150 mL的50%乙醇，浸提48 h，经四层纱布过滤得到浸提液，-60 ℃冻干成粉末。用蒸馏水适当稀释后分别按照T-AOC、DPPH·和·OH试剂盒要求进行T-AOC、DPPH·清除率与·OH清除率的测定。

1.4 数据分析

每个样品提取3次，每次提取进行2次重复测定，以平均值±标准差表示。实验数据用软件SPSS statistics 22.0进行单因素方差分析，组间采用最小显著差数法进行两两比较；利用软件Origin 8.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 4种石斛花理化指标比较分析

4种石斛花中均检测到PP、FAA、PS及SS(图2)。PP含量为6.28%～14.58%，各石斛花之间差异显著(P< 0.05)，其中，DOF中PP含量最高，DCF含量最低。FAA在DOF中的含量最高(2.37%±0.07%)，在DSF中次之(2.23%±0.11%)，在DDF中再次之(1.64%±0.05%)，在DCF中最低(0.94%±0.07%)，且相互之间差异显著(P<0.05)。对机体免疫力具有增强作用的PS[2-3]在DOF中的含量最高(5.73%±0.04%)，在DCF中次之(4.82%±0.39%)。SS在DCF中含量最高(53.46%±0.68%)，在其余3种石斛花中无显著性差异(P>0.05)。

不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.2 4种石斛花功能性成分比较分析

在4种石斛花中共检测出24种功能性成分；除DSF没有检测到Val，其余3种石斛花均检测到16种氨基酸，包括6种必需氨基酸(Ile、Leu、Met、Val、Phe、Thr)；除DDF没有检测到Tax，DCF没有检测到Ru、Lu，其余两种石斛花均检测到6种类黄酮物质(My、Qu、Lu、Kf、Tax、Ru)，如表1所示。

由表1可知，DSF的氨基酸总含量最高[(8.95±0.78)mg/g]，其次是DDF的氨基酸含量[(6.58±0.36)mg/g]，再次是DOF的氨基酸含量[(4.93±0.31)mg/g]，DCF的氨基酸总含量最低[(3.07±0.19)mg/g]，且4种石斛花氨基酸总含量之间存在显著性差异(P<0.05)。其中，Arg、Asp、Cys、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Thr、Tyr12种氨基酸的含量在DSF中最高，Ala、His、Val3种氨基酸的含量在DDF中最高，Ser的含量在DOF中最高。类黄酮物质的总量在DDF中最高，达到了(5.87±1.41)mg/g；在DOF中其次，为(2.07±0.20)mg/g；在DSF中再次，为(1.01±0.41)mg/g；在DCF中最低，为(0.43±0.11)mg/g；4种石斛花类黄酮物质总含量相互之间存在显著性差异(P<0.05)。其中，具有改善机体脂肪代谢、抑制甘油三酯积累功能的Qu[31]在DDF中含量最高，为(3.61±0.76)mg/g；具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化应激等生理功能的Tax[32]在DOF中含量最高，为(0.23±0.07)mg/g；用于心血管疾病等的治疗与预防的Kf[33]在DDF中含量最高，为(1.51±0.30)mg/g；能改善由免疫应答引起的炎症反应的My[34]在DDF中含量最高，为(0.65±0.29)mg/g；能有效消除自由基的Ru[35]在DSF中含量最高，为(0.61±0.17)mg/g；具有抗过敏、抗炎活性、降尿酸功能的Lu[35]在DDF中含量最高，为(0.06±0.01)mg/g。

表1 石斛花样品功能性成分含量Table 1 Contents of functional components of Dendrobium’s flower

2.3 4种石斛花乙醇提取物抗氧化能力比较分析

氧化衰老是生物随着时间推移自发的必然过程，延缓衰老是医药学家研究的重点[2-3]。4种石斛花乙醇提取物抗氧化活性测定结果如图3所示。由图3(a)可知，4种石斛花醇提物总抗氧化能力均随着浓度增加而增强；浓度在1.5～4.0 mg/mL变化时，4种石斛花醇提物总抗氧化能力的高低顺序均为：DSF>DOF>DDF>DCF，且在同一浓度条件下，4种石斛花醇提物的总抗氧化能力差异显著(P<0.05)；当浓度在4.0 mg/mL时，DSF的总抗氧化能力最强，为(98.76±0.96)U。

自由基被认为是人体氧化衰老的主要因素，清除自由基的能力经常被作为抗氧化能力的评价指标[2-3]。由图3(b)知，4种石斛花乙醇提取物浓度从0.15 mg/mL增加到0.45 mg/mL时，DDF对DPPH·清除能力均显著高于另外3种石斛花(P<0.05)，其半抑制浓度(IC50)为0.054 1 mg/mL；DSF、DOF、DCF对DPPH·清除能力依次减弱，IC50分别为0.150 4、0.252 6、0.468 1 mg/mL。由图3(c)知，4种石斛花乙醇提取物浓度从0.40 mg/mL增加到1.00 mg/mL时，DDF对·OH清除能力均显著高于另外3种石斛花(P<0.05)，其IC50为0.509 2 mg/mL；DCF、DSF、DOF对DPPH·清除能力依次减弱，IC50分别为0.552 6、0.596 2、0.712 1 mg/mL。综上，DDF与DSF相对于DOF和DCF具有较强的抗氧化能力。

同一浓度不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.4 4种石斛花化学成分与抗氧化活性相关性分析

研究表明多酚与类黄酮物质是石斛花的抗氧化活性成分[2-3]，但石斛花中含有多种化学成分，因此进一步分析了本研究检测到的化学成分与抗氧化能力之间的相关性，其结果如图4所示。结果表明，Ru、Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Tyr、Cys、Met、Phe、Ile、Leu、PP、FAA均与总抗氧化能力呈正相关(P<0.01)，PS与总抗氧化能力呈负相关(P<0.01)；除Tax、Pro、PS与DPPH·清除能力相关性不显著外，其余化学成分均与DPPH·清除能力呈正相关(P<0.05)；Glu、Gly、Thr、Ala、Arg、Tyr、Cys、Met、Phe、Ile、Leu均与·OH清除能力呈正相关(P<0.01)，Tax、Ser、PS均与·OH清除能力呈负相关(P<0.01)。由此可见，4种石斛花检测到的化学成分除Tax、Pro、PS外，其他成分对石斛花的抗氧化活性均具有一定的贡献。

图4 化学成分含量与抗氧化活性相关性分析Fig.4 Correlation among levels of chemical components and antioxidant activities

3 讨论

氨基酸是有机体细胞的基本组成成分，是生物体合成蛋白质的基本原料，在生物体的生长代谢过程中起着关键作用[36]。4种石斛花均含有人体所必需的6种氨基酸，且以DSF的含量最高。

自由基又称为游离基，它是单质或化合物的均裂而产生的带有未成对电子的原子或基团[37]。已有研究证明，自由基参与多种疾病的病理过程。自由基清除剂在清除机体自由基,保护机体免受氧化损害中起重要作用[38-39]。天然的自由基清除剂已成为医学、药学、食品科学等领域的研究热点[40]。氧化衰老是生物随着时间推移自发的必然过程，延缓衰老是医药学家的重点研究课题。自由基被认为是人体氧化衰老的主要因素，清除自由基的能力经常被作为抗氧化能力的评价指标。研究表明，铁皮石斛黄酮类化学成分主要集中于铁皮石斛花中[20]。通过对4种石斛花的抗氧化能力检测和比较，4种石斛花对DPPH自由基、羟自由基均具有较好的清除能力。其中，以DDF对自由基的清除能力最强，与具有良好抗氧化活性的类黄酮物质的总量在DDF中最高的结论相一致。

2018年6月中华人民共和国国家卫生健康委员会发布通告将铁皮石斛花新食品原料申请列入终止审查目录，铁皮石斛花相关产品开发利用进一步扩大，多个省份已经出台相关食品安全标准。其他石斛花相关地方标准的制定也正在进行中。进行4种石斛花氨基酸检测，为其余3种石斛花作为食品新原料开发提供一定的理论支持。可为后续开发提取石斛花氨基酸产品相关产品提供理论支持。以期随着中国大健康产业的发展，石斛花能得到更加充分利用，石斛产业的经济效益增加，石斛产业良性发展。综上所述，4种石斛花的开发有利于解决石斛花资源利用不充分的问题，对石斛产业的良性发展有重要作用。

4 结论

测定了DOF、DOF、DCF、DSF4类石斛花的理化指标、功能性成分与抗氧化活性。结果表明，4种石斛花中PP、FAA、PS和SS的含量分别为6.28%～14.58%、0.94%～2.37%、1.47%～5.73%和46.85%～53.46%，其中，PP、FAA、PS在DOF中含量最高，SS在DCF中含量最高。DSF的氨基酸总含量最高，为(8.95±0.78)mg/g，且4种石斛花氨基酸总含量之间存在显著性差异(P<0.05)。类黄酮物质的总量在DDF中最高(5.87±1.41) mg/g，且4种石斛花相互之间存在显著性差异(P<0.05)。DSF的总抗氧化能力最强，DDF对DPPH·清除能力及·OH清除能力最强。此外，相关分析发现Ru、Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Tyr、Cys、Met、Phe、Ile、Leu、PP、FAA与抗氧化活性正相关(P<0.01)。因此，试验结果为今后石斛花相关的健康产品等研发奠定了一定的基础。