丁基苯酞对创伤性脑损伤模型大鼠神经功能的改善作用*

2021-04-28桂水清黄贤键朱栋梁

中国药业 2021年8期

何云，桂水清，黄贤键，朱栋梁

（广东省深圳市第二人民医院，广东深圳 518035）

创伤性脑损伤（TBI）已成为严重的公共卫生问题，但目前尚缺乏有效的治疗方法［1］。除了在创伤事件发生后立即发生原发性机械损伤外，还会继发脑损伤神经细胞死亡［2］。在中枢神经系统（CNS）中，蛋白激酶C 受体1（RACK1）可募集并结合许多激酶和受体，从而达到保护神经细胞的目的［3］。近端内质网应激传感器肌醇酶1（IRE1）信号通路的激活也可通过RACK1 的直接结合而触发［4］。激活的IRE1 通过编码转录因子X-box 结合蛋白1（XBP1）发挥作用，并协调如葡萄糖调节蛋白78（GRP78）等未折叠蛋白反应（UPR）基因的表达［5］。有研究表明，IRE1／XBP1 信号通路在CNS 疾病中可预防神经细胞凋亡。低表达的XBP1 可抑制神经细胞中淀粉样β 神经毒性，而XBP1 的过表达会触发帕金森病模型小鼠中多巴胺能神经细胞的变性［6-7］。丁基苯酞（NBP）已被批准用于预防脑缺血［8］，但尚不清楚NBP 是否对TBI模型大鼠的神经功能有改善作用，本研究中拟就此问题进行探讨。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器：HBS-1096B 型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；ASP300S 型组织脱水机、1150 型包埋机、RM2255 型全自动轮转切片机（德国Leica 公司）；E400 型光学显微镜（日本Nikon 公司）；GelDoc-It2 310型凝胶成像仪（美国UVP 公司）；165-8033 型垂直电泳仪（美国Bio-Rad 公司）。

试剂：NBP（美国Sigma 公司）；苏木素染色液（上海碧云天生物技术研究所）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，均购自上海生工生物工程有限公司；蛋白抽提试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；RACK1、磷酸化 IRE1（p - IRE1）、XBP1、GRP78、β-actin 抗体（美国Santa Cruz 公司）；纯化山羊抗小鼠IgG 二抗（武汉艾美捷科技有限公司）；水为纯化水。

动物：SD 大鼠，雄性，体质量（200±20）g，购自吉林大学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（吉）2017-0001，动物质量合格证号为2018112304。在环境温度（23±2）℃，相对湿度60% ～70%，光照12 h 明暗交替环境中适应性喂养1 周后进行试验。

1.2 方法

模型制备及分组、给药：将60 只大鼠分为假手术组（等体积生理盐水），模型组（等体积生理盐水），NBP 低、中、高剂量组（10，20，40 mg／kg），各12 只。采用改良Feeney 自由落体撞击法制备大鼠TBI 模型。麻醉后将大鼠俯卧固定在立体定位仪上，备皮消毒后切开头部皮肤，于冠状缝后中线右侧开3 cm 磨取5 mm 的骨窗，用颅脑撞击器在硬脑膜上放置1 个与骨孔大小吻合的垫片及直径4 mm 的撞针，用40 g 砝码从40 cm 高处自由落体撞击撞针，造成大鼠右侧大脑半球脑挫裂伤。假手术组只磨取骨窗，不予撞击。缝合切口，待大鼠麻醉清醒后，各组大鼠分别腹腔注射相应药物（注射体积每100 g体质量2 mL），每日1 次，连续7 d［9］。

神经功能缺损评分：末次给药1 h 后评估神经功能，完全无法走路计5 分，无法自发行走和失去知觉计4 分，走路时向内倾斜计3 分，走路时向内旋转计2 分，前爪无法完全伸展计1 分，无神经功能障碍表现计0 分。

脑组织含水量检测：处死大鼠，取脑组织，去除软脑膜和凝血块，每组4 只以福尔马林固定，4 只以液氮保存，4 只进行脑含水量测定。取右侧脑半球，称定体质量后置60 ℃烤箱中烤至恒重，再次称定质量，计算脑组织含水量。含水量＝（湿质量-干质量）／湿质量×100%。

脑细胞凋亡检测：制备常规脑组织病理石蜡切片，经二甲苯脱蜡和无水乙醇脱水后，以TUNEL 法采用荧光显微镜检测凋亡细胞，以碘化丙啶（DAPI）反染细胞核，计算阳性细胞率。

MDA 和SOD 水平检测：制备脑组织匀浆，吸取上清液，按酶联免疫吸附法测定MDA 和SOD 水平。

RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78 表达水平检测：采用western blot 法。制备脑组织匀浆，取50 mg，加入1 mL预冷蛋白抽提试剂，冰浴2 h，离心，取上清液，100 ℃煮10 min 进行变性。各组取20 μg 上样，转模，5% 脱脂奶粉室温封闭1 h，加入RACK1（1 ∶400）、p - IRE 1（1 ∶200）、XBP1（1 ∶200）、GRP78（1 ∶300）一抗，4 ℃孵育过夜，回收一抗，TBST 清洗2 次，加入二抗（1 ∶5 000），在室温下孵育30 min，回收二抗，TBST 清洗3 次，加入ECL 化学发光试剂，将PVDF 膜放入暗盒中，压上X 胶片，取出胶片后显影、定影、清洗。然后，通过Image J 软件将条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计学软件分析。定量资料以表示，行LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对神经功能缺损评分和脑组织含水量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分和脑组织含水量显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，NBP 高、中、低剂量组大鼠神经功能缺损评分和脑组织含水量显著降低，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。详见表1。

2.2 对脑细胞凋亡的影响

与假手术组大鼠细胞凋亡指数［（0.48±0.17）%］比较，模型组大鼠［（6.30±0.52）%］显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，NBP 低、中、高剂量组大鼠凋亡指数［（3.62±0.48）% ，（2.51±0.37）% ，（1.10±0.27）% ］均显著降低，且呈剂量依赖关系（P＜0.05）。详见图1。

2.3 对脑组织匀浆中MDA 和SOD 水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织匀浆中MDA水平显著升高，SOD 水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，NBP 低、中、高剂量组大鼠脑组织匀浆中MDA水平显著降低，SOD 水平显著升高，且呈剂量依赖关系（P＜0.05）。详见表2。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分和脑组织含水量比较（±s，n ＝4）Tab.1 Comparison of neurological deficit score and brain water content of rats in each group（±s，n ＝4）

注：与假手术组比较，a P ＜0.05；与模型组比较，b P ＜0.05；与NBP 低剂量组比较，c P ＜0.05；与NBP 中剂量组比较，d P ＜0.05。表2、表3 同。Note：Compared with those in the sham operation group，a P ＜0.05；compared with those in the model group，b P ＜0.05；compared with those in the NBP low-dose group，c P ＜ 0.05；compared with those in the NBP medium-dose group，d P ＜0.05；as well as Tab.2 and Tab.3.

组别假手术组模型组NBP 低剂量组NBP 中剂量组NBP 高剂量组剂量（mg／kg）10 20 40神经功能缺损评分（分）0 3.40±0.28a 2.84±0.36b 1.88±0.27bc 1.15±0.12bcd脑组织含水量（%）77.54±0.28 82.23±0.49a 80.68±0.51b 79.25±0.35bc 78.91±0.41bcd

2.4 对脑组织匀浆中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78 表达水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织匀浆中RACK1 水平显著降低，p-IRE1，XBP1，GRP78 水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，NBP 低、中、高剂量组大鼠脑组织匀浆中RACK1 水平显著升高，p-IRE1，XBP1，GRP78 水平均显著降低，且呈剂量依赖关系（P＜0.05）。详见表3 及图2。

A. 假手术组 B. 模型组 C.NBP 低剂量组 D.NBP 中剂量组 E.NBP 高剂量组图1 大鼠脑细胞凋亡情况A.Sham operation group B.Model group C.NBP low-dose group D.NBP medium-dose group E.NBP high-dose groupFig.1 Apoptosis of brain cells of rats

表2 各组大鼠脑组织匀浆中MDA 和SOD 水平比较（±s，n ＝4）Tab.2 Comparison of MDA and SOD levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

组别假手术组模型组NBP 低剂量组NBP 中剂量组NBP 高剂量组剂量（mg／kg）10 20 40 MDA（nmol／mg）4.78±0.57 12.09±1.82a 9.52±0.43b 7.68±0.83bc 6.02±0.70bcd SOD（U／g）24.35±3.42 7.34±0.40a 9.75±0.98b 13.84±2.46bc 17.28±3.61bcd

表3 各组大鼠脑组织匀浆中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78表达水平比较（±s，n ＝4）Tab.3 Comparison of RACK1，p-IRE1，XBP1 and GRP78 expression levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

组别假手术组模型组NBP 低剂量组NBP 中剂量组NBP 高剂量组剂量（mg／kg）10 20 40 RACK1 3.28±0.41 0.62±0.07a 1.28±0.25b 1.83±0.37bc 2.69±0.13bcd p-IRE1 0.42±0.05 1.82±0.29a 1.53±0.09b 1.30±0.21bc 0.94±0.08bcd XBP1 0.45±0.07 1.27±0.28a 0.85±0.14b 0.73±0.09bc 0.55±0.06bcd GRP78 0.19±0.04 1.76±0.18a 1.27±0.25b 0.54±0.04bc 0.33±0.05bcd

3 讨论

TBI 24 h 后，外伤皮质周围氧化产物（MDA）水平升高，抗氧化酶活性减弱［10］。本研究中，NBP 可减轻TBI模型大鼠的氧化应激水平，减轻脑水肿症状，并改善神经功能评分，抑制神经细胞凋亡。氧化应激在TBI 病理过程中扮演重要作用。为了缓解氧化应激，细胞激活UPR 级联反应，其目的是通过减少错误折叠蛋白的负荷来重建内质网蛋白稳定，抑制细胞凋亡［11］。最保守的UPR 信号传导途径是由IRE1 的激活引发的，IRE1 在增强细胞存活中起关键作用［12］。RACK1 是IRE1 信号传导的关键调节剂。敲除RACK1 的阿尔茨海默病（AD）模型，小鼠的大量神经细胞凋亡和神经功能损伤［13］。本研究中TBI 模型大鼠脑组织中RACK1 水平降低，与上述研究一致。相反，RACK1 过表达可显著改善脑外伤后的继发性脑损伤，NBP 可提高脑组织中RACK1 水平［14］。RACK1 的神经保护作用可能是通过激活IRE1 磷酸化来实现的，一旦被激活，IRE1 作为跨膜激酶催化去除编码XBP1 的内含子，产生剪接的XBP1 mRNA，产生功能性XBP1 蛋白［15］。RE1 磷酸化导致了功能性转录因子XBP1 及其下游靶基因GRP78 的产生［16］。RACK1 以葡萄糖刺激或氧化应激反应的方式与IRE1 相互作用，从而激活IRE1。有研究使用IRE1 抑制剂十二烷基苯磺酸（DBSA）进行论证性研究，结果显示，DBSA 特异性降低IRE1 磷酸化水平而抑制IRE1 的激活［17］。XBP1 充当转录因子，结合细胞核中的应激元件启动子并促进GRP78 表达，以恢复蛋白质的正确构象，并维持神经细胞稳态。研究表明，磷酸化的IRE1 和XBP1 表达在试验性脑缺血和创伤后应激障碍模型动物中增加，并促进神经细胞凋亡［18］。本研究结果显示，NBP 抑制了IRE1／XBP1 信号通路，降低了脑组织中GRP78 水平。

A. 假手术组 B. 模型组 C.NBP 低剂量组D.NBP 中剂量组 E.NBP 高剂量组图2 大鼠脑组织匀浆中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78表达水平A.Sham operation group B.Model group C.NBP low-dose group D.NBP medium-dose group E.NBP high-dose groupFig.2 Expression levels of RACK1，p-IRE1，XBP1 and GRP78 in brain homogenate of rats in each group

综上所述，NBP 对TBI 模型大鼠神经功能有一定改善作用，其机制与抑制IRE1／XBP1 信号通路有关。