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Nef对乳腺癌细胞survivin与RASSF2基因的调控及细胞凋亡*

2021-04-28贾丽君尹晓然昝瑛

西部医学 2021年4期
关键词:癌细胞荧光数量

贾丽君 尹晓然 昝瑛

(西安交通大学第二附属医院肿瘤科,陕西 西安 721000)

乳腺癌是女性易患的恶性肿瘤之一,其中,乳腺癌又分为原发性乳腺癌和继发性乳腺癌。原发性乳腺癌是指发生于乳腺本身,而不是继发于其他组织器官转移而形成的恶性肿瘤;继发性乳腺癌是指其他部位癌细胞转移至乳腺,最终形成乳腺癌[1]。甲基莲心碱 (Neferine, Nef)是一种双苄基异喹啉类生物碱,具有降压、抗血栓形成、抗氧化等多种临床作用。最近相关研究发现,Nef对乳腺癌细胞具有一定作用,但具体作用效果及机制尚未明确[2]。Survivin 属于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Protein, IAP)家族,Survivin会在多种人类肿瘤中过度表达[3]。Survivin的过量表达抑制细胞凋亡,并促进肿瘤的进展和对抗癌药物和放射线的抵抗,但尚不清楚Survivin在乳腺癌细胞中的作用机制[4]。RASSF2是新近发现的抑癌基因,对肺癌、肝癌等癌细胞的生长具有明显抑制作用,但对乳腺癌细胞的作用研究报道较少[5]。因此,本研究旨在探讨Nef对乳腺癌细胞survivin、RASSF2基因的调控及细胞凋亡的情况。

1 材料与方法

1.1 一般材料 将在ATCC细胞库购买的乳腺癌细胞株zr-75-30细胞分为癌细胞组(CC组):单纯zr-75-30细胞不做其他处理,正常培养;低浓度组(LC组):将zr-75-30细胞与浓度为5 mg/kg Nef混合培养;中浓度组(MC组):将zr-75-30细胞与浓度为10 mg/kg Nef混合培养;高浓度组(HC组):将zr-75-30细胞与浓度为20 mg/kg Nef混合培养。

1.2 实验仪器与试剂 Nef(大连美仑生物技术有限公司);PVDF 膜(Millipore,美国);高压灭菌锅(Hirayama Manufacturing,日本)。

1.3 细胞培养 将zr-75-30细胞株在含有胎牛血清的DMEM培育液中培养。当细胞数量为80%~90%时,胰蛋白酶消化zr-75-30细胞,消化后,采取1600 r/min进行离心,时间为5 min,收集、重悬并培养细胞。将细胞接种在96孔板上,密度为1×104个细胞/孔,在5%CO2+95%空气的混合气体中培养过夜,然后加入5、10、20 mg/kg浓度的Nef混合液培养24 h。

1.4 Hoechst 33258 荧光染色法检测zr-75-30凋亡 按 Hoechst 染色试剂盒说明书操作[6]。荧光显微镜下观察并拍摄图片,以细胞皱缩、胞核致密浓染、荧光强度增强等作为细胞凋亡指标。

1.5 流式细胞仪检测zr-75-30细胞凋亡情况 调整zr-75-30细胞密度为1.2×106/L,接种于6 孔板中,处理12 h,继续培养24 h。0.01 mol/L PBS洗涤,300×g离心5 min,置-4 ℃冰箱培养,PBS洗涤3次,37 ℃水浴30 min,吹打均匀,4 ℃避光孵育30 min。使用Guava流式细胞仪进行流式上样检测。

1.6 Western blot法检测zr-75-30细胞中survivin的蛋白含量 将zr-75-30细胞进行裂解并提取核蛋白,并对核蛋白的浓度进行测量,分装后,保存在-20 ℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均,按照4∶1的比例进行,为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。把电泳后的50 μm蛋白样品转移到PVDF膜上,加入脱脂奶粉,并进行封闭,时长为1 h。加入1抗后进行TTBS漂洗,每次漂洗10 min,一共进行3次漂洗,最后加入2抗对溶液进行稀释,再在常温的环境中封闭1 h。取出PVDF膜,TTBS漂洗10 min×3,DAB显色后数码相机照相。

1.7 免疫组化法检测zr-75-30细胞中RASSF2的蛋白含量 将zr-75-30细胞入二甲苯中处理,完成后,再分别浸入不同浓度的酒精中。在100 mL 0.01 mol枸櫞酸缓冲液冲洗、浸泡,PBS冲洗3次,加热修复15 min,冷却至室温。冲洗,室温封闭,滴加一抗(兔抗人RASSF2抗体)37 ℃ 30~40 min,冲洗,滴加生物素化二抗37 ℃ 40 min,冲洗,DAB显色,水洗终止反应,苏木素复染,分化,梯度酒精脱水干燥,中性树胶封固。

1.8 qRT-PCR法检测zr-75-30细胞中survivin、RASSF2 mRNA的表达含量 把保存在-80 ℃环境中的zr-75-30细胞取出。将液氮冷冻中的zr-75-30细胞进行研磨, 用Trizol进行总RNA的提取,逆转录按照说明书严格进行,将逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增,内参采用GAPDH,变性3 min 95 ℃,变性5 s 95 ℃,退火1 min 60 ℃,一共40个循环。取得到的平均值后得到Ct值,计算方法用2-△△Ct法进行分析,见表1。

2 结果

2.1 Hoechst 33258 荧光染色法检测zr-75-30细胞凋亡情况 CC组、LC组、MC组及HC组细胞凋亡数量分别为(156.25±56.24)、(247.01±63.84)、(297.35±70.14)、(516.54±102.36)个。CC组zr-75-30细胞荧光强度较弱,凋亡数量较少,LC组、MC组及HC组细胞的细胞核出现核固缩的概率显著高于CC组(均P<0.05);其中,HC组与LC组、MC组相比,HC组细胞凋亡细胞数量最多(P<0.05),见图1。

表1 引物序列

图1 各组细胞凋亡情况

2.2 流式细胞仪检测zr-75-30细胞凋亡情况 CC组、LC组、MC组及HC组细胞凋亡率分别为0.31±0.09、0.45±0.12、0.64±0.18、0.76±0.21。HC组zr-75-30细胞凋亡数量最多,凋亡率最高;CC组zr-75-30细胞凋亡数量最少,凋亡率最低;LC组、MC组细胞的凋亡数量显著低于HC组(均P<0.05),见图2。

图2 各组乳腺癌细胞凋亡率

2.3 Western blot法检测zr-75-30细胞中survivin的蛋白含量 通过Western blot法,CC组、LC组、MC组及HC组zr-75-30细胞内的survivin蛋白含量分别为1.21±0.35、0.79±0.16、0.51±0.11、0.30±0.09。CC组zr-75-30细胞survivin蛋白表达高于LC组、MC组及HC组(均P<0.05);LC组细胞survivin蛋白表达高于MC组、HC组(均P<0.05),见图3。

2.4 免疫组化法检测zr-75-30细胞中RASSF2 的表达情况 在zr-75-30细胞中RASSF2阳性染色,呈现紫色颗粒。HC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数较多,而在CC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数较少。HC组与LC组、MC组相比,HC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数明显较高(均P<0.05)。见图4。

图3 各组细胞中survivin的蛋白含量

图4 各组细胞中RASSF2的表达

2.5 qRT-PCR法检测zr-75-30细胞中survivin、RASSF2 mRNA的表达含量 CC组、LC组、MC组、HC组zr-75-30细胞中的survivin mRNA表达量分别为1.03±0.21、0.76±0.16、0.61±0.14、0.37±0.08,RASSF2 mRNA表达含量分别为0.43±0.09、0.73±0.14、0.85±0.18、1.06±0.26。HC组zr-75-30细胞中的survivin mRNA表达量最低,CC组zr-75-30细胞中表达量最高;HC组与LC组、MC组相比,survivin mRNA含量明显较低(均P<0.05),RASSF2 mRNA表达含量与survivin相反,见图5。

图5 各组细胞中survivin、RASSF2 mRNA表达含量

3 讨论

乳腺癌发病率已位居妇科癌症首位。中国属于发病率较低的国家,但是,近年来增长速度却持续升高[7]。我国乳腺癌患者年龄逐渐下降,平均比其他国家女性早10~15年。现今,乳腺癌已引起临床及科研人员高度关注[8]。虽然现在手术治疗,术后的化、放疗发展迅速,但仍不能阻碍癌细胞转移。乳腺癌的转移、复发严重影响患者的康复时间,给治疗增加了很多困难[9-10]。近年来,国内在治疗乳腺癌方面获得了较多成就,但癌细胞转移情况时有发生,发生率也同样居高不下[11]。与其它肿瘤的发生相似,乳腺癌癌变是一个长期、多步骤的疾病过程,涉及了复杂的遗传表观、遗传异常等[12]。对乳腺癌患者转移情况的进行把控,缓解患者治疗时所受的痛苦,抑制肿瘤发展是目前医学界研究的重点。

Nef属于中药及天然药物提取范畴,近年来,其医学作用逐渐被证实。临床试验研究显示,Nef在多种疾病中均有一定作用,如肺癌、高血压等[13]。临床中,Nef对乳腺癌细胞存在一定作用,但具体机制尚未可知。本研究结果显示,CC组zr-75-30细胞荧光强度较弱,凋亡数量较少,LC组、MC组及HC组细胞的细胞核出现核固缩的概率显著高于CC组,其中,HC组与LC组、MC组相比,HC组细胞凋亡细胞数量最多(均P<0.05)。HC组zr-75-30细胞凋亡数量最多,凋亡率最高;CC组zr-75-30细胞凋亡数量最少,凋亡率最低;LC组、MC组细胞的凋亡数量显著低于HC组。Nef具有抗炎、降血压等多重作用,在心律失常、肿瘤等多种疾病中具有治疗作用[14]。有临床实验研究显示,Nef能预防动脉粥样硬化和再狭窄的产生,同时可抑制多种癌症疾病的发展速度,达到治疗效果。Nef浓度能够显著影响乳腺癌细胞的活性,与癌细胞的恶性度关系显著,Nef浓度越高,能使其恶性度显著下降,这与乳腺癌的治疗率及复发率有显著关系[15]。温海燕等[16]研究显示,Nef以时间和浓度依赖的方式抑制乳腺癌细胞增殖、细胞毒性增加,导致细胞周期于G0/G1阻滞并促进癌细胞凋亡。Nef抗乳腺癌的可能作用机制是激活线粒体凋亡途径。唐小卿[17]研究显示,Nef能逆转MCF 7/Adr细胞的凋亡抗性,其作用机制可能与抑制P gp的功能和表达、增加ADR在MCF 7/Adr细胞内的积累有关。

本研究结果显示,HC组zr-75-30细胞中survivin蛋白表达最低,CC组zr-75-30细胞survivin蛋白表达高于LC组、MC组、HC组,LC组细胞survivin蛋白表达高于MC组、HC组。CC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数较少,HC组与LC组、MC组相比,HC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数显著较高。HC组zr-75-30细胞中的survivin mRNA表达量最低,CC组zr-75-30细胞中表达量最高;HC组与LC组、MC组相比,HC组zr-75-30细胞中survivin mRNA含量明显较高,RASSF2 mRNA表达含量与survivin相反。细胞凋亡调节异常通过异常延长细胞存活、促进转化突变的积累和增强对免疫监视的抵抗力而与癌症发生有关。最近,survivin作为IAP家族的一个新成员引起了广泛的关注,并参与细胞凋亡和细胞周期进程的调节。基于其抗凋亡功能,survivin的干扰蛋白表达降低了人类异常有丝分裂细胞的生存力,抑制肿瘤的发展,并促进肿瘤细胞的凋亡[18]。通过抑制Survivin基因的表达,细胞凋亡会明显增加,survivin可能是包括乳腺癌在内的肿瘤的重要治疗靶点。侯歌等[19]研究显示,对Survivin表达水平的检测有望成为乳腺癌含紫杉醇化疗方案的预测指标,且针对Survivin高表达患者联合复方苦参注射液可能提高化疗的有效率,甚至延长PFS。RASSF2是RASSF家族重要成员,在多种人类肿瘤中均存在其异常甲基化而表达沉默。RASSF2具有促进凋亡和细胞周期停滞、抑制生长的作用[20-21]。在肿瘤大鼠体内RASSF2高表达能减缓大鼠癌细胞扩散生长,同时,下调RASSF2的表达含量能够促进癌细胞增殖,表明RASSF2与肿瘤的发展有密切关系[22-23]。马腾飞等[24]研究显示,5-Aza-CdR可通过逆转RASSF2A基因异常甲基化导致该基因表达上调来抑制MCF-7细胞增殖,RASSF2A是一个乳腺癌相关抑癌基因。有研究报道,Nef可能通过靶向作用于多种蛋白促进乳腺癌细胞凋亡等生物学过程。因此,采用Nef达到治疗乳腺癌的目的,为乳腺癌的诊断和治疗发展新方向[25]。

4 结论

Nef对乳腺癌(zr-75-30)细胞的凋亡存在促进作用,且与浓度呈正相关,在20 mg/kg浓度下促进效果最佳,其作用原理可能与Nef抑制细胞中survivin表达及上调RASSF2表达有关。

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