低温贮藏对草莓苗的生理变化及生长发育的影响

于红梅，袁华招，关 玲，陈晓东，唐山远，王庆莲，赵密珍

（1江苏省农业科学院果树研究所，江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，南京210014；2句容市白兔草莓研究院，江苏镇江212403）

0 引言

草莓(Fragaria ananassaDuch)属蔷薇科草莓属多年生草本植物，其色泽艳丽，风味独特，营养丰富，素有“水果皇后”之美誉[1]。因其种植周期短、见效快、经济效益高、适应性强，已成为中国一些农村地区的经济支柱。据中国园艺学会草莓分会统计，2018年中国草莓总面积超17万hm2，总产量500万t，在所有农作物中草莓的增幅位居前茅，已成为世界第一草莓生产大国和第一消费大国，占世界总产量的50%以上[2-4]。“小草莓，大产业”，随着草莓鲜果产业不断蓬勃发展壮大，育苗产业的快速兴起，市场对草莓鲜果和种苗提出了耐储运、损耗小、质量更优的新要求。

“见苗三分收”，种苗质量是草莓安全优质生产的基础，而运输种苗对整个产业的发展也是至关重要的。最近几年，随着物流运输业的快速发展和草莓经济效益的稳定提高，专业化异地育苗加速了进程，并呈快速扩大态势。专业苗圃向云贵川和东北等夏季冷凉地区转移，育苗环境得到了改善，种苗质量得到了保证，但长距离运输带来了种苗发热、脱水等生理胁迫问题。另外，草莓设施栽培定植时间比较集中，在8月下旬到9月中旬市场对种苗需求量大，短时间供需难以平衡，也制约草莓育苗产业的发展[5-6]。为缓解种苗供需不平衡和运输途中技术障碍，目前在草莓苗贮藏技术方面开展了对草莓生长发育及果实性状的穴盘苗变温补光、低温保湿等应用研究[7-8]，及低温胁迫对种苗生理指标变化的保护机制[9-10]，但未能将低温贮藏期生理变化对种苗质量、定植移栽后物候期以及产量的影响有机结合。本试验探索草莓裸根苗低温贮藏的生理变化以及经过长时间冷藏后对后期生长发育产量的影响，旨在为草莓裸根苗冷藏和运输技术提供参考，利于建立草莓种苗冷藏和运输体系。

1 材料和方法

1.1 试验材料与设计

1.1.1 供试材料 试验于2017年8月下旬—12月下旬在江苏省农业科学院溧水植物基地和江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室进行。供试草莓品种为‘宁玉’，采用大田土壤繁殖的匍匐茎子苗，去掉子苗根部的泥土，筛选出长势一致、大小相近的子苗作为供试验种苗。

1.1.2 材料处理 将筛选出的600株种苗分成3组，于起苗当天将根部泥水保湿置于泡沫盒密封，并于5℃低温冷库贮藏。

1.1.3 试验设计

试验Ⅰ：低温贮藏条件下草莓裸根苗的生理变化。分别于贮藏后1、3、8、14、21天取10株草莓种苗的根和叶，用液氮处理置-80℃保存，重复3次，测定根和叶的生理和激素指标。

试验Ⅱ：低温贮藏后对草莓裸根苗的物候期以及生长发育的影响。分别于贮藏后1、3、8、14、21天取20株草莓种苗移栽定植大棚，重复3次，调查物候期和统计产量。

1.1.4 栽培管理 每条高架定植试验草莓种苗2行，行距20 cm、株距15 cm。栽种时选用生长一致3叶以上的种苗，定植后连续微喷保湿促活。试验高架管理方法与其他高架一致。

1.2 指标测定

1.2.1 生理生化指标 种苗生理生化指标试验总超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性以及可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛(MDA)和叶绿素含量均采用紫外分光光度法测定[11-13]。每生物学重复均称取草莓待测组织约0.5 g放于研钵中研磨，具体提取方法及酶活力的测定方法参照南京建成生物工程研究所(www.njjcbio.com)生产的保护酶活力测定试剂盒说明书。

1.2.2 内源激素测定 称取液氮中研磨待测组织约0.1 g于5 mL离心管，加入1 mL提取液（2-丙醇：H2O:HCL=2:1:0.002），4℃条件下，震荡提取30 min，再加入2 mL二氯甲烷震荡提萃取30 min，然后13000 r/min离心5 min。取下清液2 mL到棕色玻璃管中，氮气吹（不完全吹干），然后用200µL甲醇溶解，0.22µm过滤，采用Agilent Technologies LC-MS 6490型检测。液相条件：色谱柱型号Agilent Poroshell 120 EC-C18，流动相为超纯水(H2O)和乙腈(MeOH)，洗脱梯度如表1所示，进样量5µL，检测波长254 nm，外标法；质谱条件：正离子模式，补偿电压为4 kV，气压为45 psi，温度为350℃，透镜电压为135 V。

表1 HPLC洗脱梯度

1.2.3 物候期及产量 根据《草莓种质资源描述规范和数据标准》调查物候期，并统计各处理草莓产量。

2 结果与分析

2.1 低温贮藏条件下草莓裸根苗根和叶的生理变化

2.1.1 对草莓种苗叶绿素含量的影响 叶绿素是植物光合作用的重要场所，检测叶绿素含量的多少可从侧面说明低温、无光环境是否适宜贮藏草莓裸根苗。由图1可知，在同样低温条件下，随着贮藏时间的延长，‘宁玉’草莓叶片叶绿素a，叶绿素b含量以及叶绿素a/b比值均呈现降低趋势。叶绿素a前8天含量下降缓慢，幅度0.09 mg/g，8天后下降速度有所加快，幅度0.28 mg/g；叶绿素b始终缓慢下降，前后速度变化不大，幅度只有0.10 mg/g；而叶绿素a/b比值虽有下降趋势，但比值始终在2以上。说明5℃低温、无光的环境一方面降低种苗呼吸，减少能耗，也可能激发生理活性保护种苗从而延长种苗保存时间。

图1 低温贮藏时间对草莓种苗叶绿素的影响

2.1.2 对草莓种苗保护酶活性的影响 抗氧化系统SOD和POD是植物防御系统重要的保护酶，反映植物氧化代谢水平的高低，其酶的活性高有利于保持植物细胞结构的完整性，可以提高细胞对不良环境抗性的作用。低温贮藏后草莓植株叶片和根系总SOD活性总体表现为下降（图2A、B），POD活性表现为上升（图2D）；而在相同贮藏时间下表现出叶片中总SOD明显低于根系（图2C），而POD截然相反，表现为根系明显低于叶片（图2D）；从贮藏到结束，叶片中总SOD下降46.52%，其中8天下降幅度最大18.08%，POD上升幅度40.13%，8天后上升幅度明显缓慢；根系中总SOD下降14.68%，POD上升428.73%。以上结果说明低温贮藏胁迫草莓植株，体内SOD和POD活性应急改变以提高抵御低温逆境的能力。

图2 低温贮藏时间对草莓种苗保护酶活性的影响

2.1.3 对草莓种苗渗透调节物质及丙二醛含量的影响MDA是膜脂过氧化的主要最终产物，常被作为判断膜脂过氧化作用的一个主要指标，其含量的高低反映了膜系统受害的水平。低温贮藏后草莓植株MDA含量的影响由图3，A可知，叶片的MDA含量始终高于根系，且随着低温胁迫时间的延长，表现先降低后升高波动趋势，1～3天短时间低温贮藏，MDA明显下降18.45%，之后MDA有所升高，8天再次出现峰值达89.82%，在整个低温贮藏过程中，叶片的MDA始终是降低的，21天贮藏结束降至88.85%。而根系的MDA含量表现为先升高后降低，变化趋势与叶片基本一致，但反应滞后于叶片，说明MDA在低温贮藏过程中抵御胁迫，发挥保护作用。

图3 低温贮藏时间对草莓种苗渗透调节物质及丙二醛(MDA)的影响

图3B显示，在低温贮藏过程中草莓植株根系的渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖含量均发生不同程度的变化。脯氨酸表现为先升高后下降，3天出现峰值达到250.12%，在下降的过程中，3～8天下降幅度较大104.57%，8天后平稳下降至结束，21天脯氨酸含量117.57%。在受到低温胁迫后，可溶性糖含量前期随贮藏时间的延长而呈现降低趋势，结束时有所反弹。以上结果说明在低温贮藏的胁迫下，脯氨酸积极发挥调节胞质和液泡之间的渗透液的平衡功能，前期快速积累保护可溶糖等渗透胁迫的细胞结构，稳定细胞膜完整性，提高植株抗逆能力。

2.2 低温贮藏条件下草莓裸根苗短缩茎的内源激素变化

内源激素是植物体内产生的一些微量而能调节自身生理过程的有机化合物，如IAA、ABA、GA3对植物的生长发育有重要的调控作用。图4A结果显示IAA先降低在升高，1～3天急速下降，8天出现峰谷，下降了60.1%；ABA结果显示低温贮藏变化趋势与IAA刚好相反（图4B），3天急速上升，8天出现峰值，增加了11.63倍；观察图4C发现GA3变化与IAA前期表现一致，不同的是前期下降速度缓慢，3～14天之间变化幅度较大，且随着低温贮藏时间的延长后期又下降。以上结果说明植株在受到低温胁迫时，启动IAA、ABA、GA3抗寒物质生成，调节代谢对抗低温，维持细胞膜结构功能，使种苗安全休眠。

图4 低温贮藏时间对草莓内源激素IAA、ABA和GA3的影响

2.3 低温贮藏后对草莓裸根苗物候期生长发育的影响

2.3.1 低温贮藏后对草莓物候期的影响 从表2可以看出，与低温贮藏1天相比，3天对草莓物候没有影响，但定植期可以晚2天；贮藏8天定植期推迟7天，显蕾期推迟3天，盛花期推迟1天，始熟期推迟4天，说明从定植到显蕾期缩短了4天、盛花期缩短了6天，始熟期提早了3天；而低温贮藏14～21天则表现为，从定植到显蕾期缩短了5～9天、盛花期缩短了0～3天，始熟期推迟了4～6天。以上结果表明，低温贮藏不同程度地促进草莓花芽分化进程，明显缩短定植到盛花期的间隔时间，且低温处理小于8天始熟期可以提早，大于14天始熟期推迟。

表2 低温贮藏时间对草莓物候的影响

2.3.2 低温贮藏后对草莓产量的影响 从表3可知，低温贮藏前1～8天各处理单株总产量差异不大，14～21天各处理也没有明显差异，但8天前后2个阶段的总产量存在显著差异，其中冷藏3天总产量最高331.25 g，14天总产量最低269.79 g。观察各个单月产量发现，12月份之前，处理1天的产量显著高于其他处理，且低温处理时间短有单株产量高的趋势；1—2月份单月产量表现为先升高降低再升高的趋势，低温处理8天出现峰值后，21天产量再次峰值；再统计比较发现，3月份之前低温处理8天产量最高，合计231.36 g，与处理小于3天相差35.09～37.16 g，说明8天低温利于提高草莓早期产量。

表3 低温贮藏时间对草莓产量的影响

3 讨论

不同贮藏条件是影响草莓苗储存质量最重要的环境因子，直接影响着草莓苗植株体内一切生理变化，也是影响草莓移栽定植、生长发育等最基本的要素[14-17]。低温是抑制草莓苗呼吸生长采用的常规技术手段，也是促进草莓花芽分化技术措施之一[18-19]。在自然状态下，生产上莓农通常就近起苗及时定植，或者12℃短时间预冷，加冰块装箱远距离运输发苗，时间控制在48 h之内。本研究在低温5℃无光照情况下，研究贮藏期间草莓苗的生理变化以及经过长时间冷藏后对后期生长发育等指标，拟建立草莓种苗冷藏和运输体系。试验结果表明‘宁玉’草莓叶片叶绿素a，叶绿素b含量以及叶绿素a/b比值均呈现降低趋势，而叶绿素a/b比值始终在2以上，初步说明5℃低温，无光照环境可以安全贮藏草莓苗，本试验虽然没有直接得出在低温5℃下光照强弱对叶绿素影响不大的结论，但验证了2009年张广华[20]研究的结论，进一步明确温度在低温贮藏过程中的主导作用，同时引起其他生理指标发生变化。低温贮藏后草莓苗叶片和根系的SOD和POD活性发生了变化，SOD活性总体下降，POD活性总体上升，与2015年何雨沩[21]研究在4℃低温条件下结果一致；本试验还发现低温贮藏前8天SOD和POD活性变化幅度较大，笔者没有查到相关文献，推测草莓根系泥水保湿8天，前期抵御外界胁迫依靠自身储存的能量，后期植株根系开始萌动参与抵御低温胁迫；另外叶片、根系中的SOD和POD活性含量不同，一方面保护酶自身是对温度敏感性不同，另一方面植株不同部位细胞结构存在区别。比如，MDA也是叶片中含量始终高于根系，在整个低温贮藏过程中，叶片中的丙二醛始终降低，变化趋势表现先降低后升高，第8天出现峰值达89.82%，21天贮藏结束降至88.85%；而根系中的MDA变化趋势表现为先升高，14天降低至峰谷，本研究得出二者变化趋势基本一致结论是基于根系低温接触面小于叶片，机制反应滞后所致；在抵御低温胁迫的过程中丙二醛变化趋势有波动，说明MDA作为判断膜脂过氧化作用的主要指标，影响脯氨酸、可溶性糖等渗透物质的代谢反应。2015年林建忠[9]研究结果表明低温胁迫可溶性糖在8 h峰值后开始下降；2019年白春雷[22]研究利用低温锻炼的方式对草莓进行处理，结果表明可溶性糖在24 h峰值后下降，但含量始终是增加的结论一致；与此同时，白春雷研究还表明脯氨酸也在24 h呈现出降低的态势，但总体含量升高。本文以第1天贮藏指标为参照，结果表明根系中的可溶性糖含量表现下降趋势至14天达峰谷，后期有所反弹；而脯氨酸表现为先升高，3天后达到峰值后下降，分析数据发现丙二醛与可溶性糖同时在14天处于峰谷，验证了丙二醛将体内储存的淀粉转化为糖相关性；脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，广泛存在于植物体中，与可溶性糖等渗透物质等联合发挥调节胞质和液泡之间的渗透液的平衡功能，稳定细胞膜完整性，提高植株抗逆能力。

植物休眠一般认为受控于赤霉素、生长素类促进物质与脱落酸类抑制物质相互作用，也是对草莓低温胁迫起应答反应，其内源激素IAA、GA3和ABA也会发生变化[10,15]。一方面，细胞中IAA、GA3含量降低，抑制草莓植株生长，促进气孔关闭，降低蒸腾和呼吸作用，并维持较高的叶绿素、可溶性糖和脯氨酸含量等以适应环境；另一方面，细胞中ABA迅速积累减弱草莓植株体内渗透物质的合成，并调节ABA、GA3、IAA平衡以发挥抵御低温的调节效应。本研究中，前8天促进物质类赤霉素GA3、生长素IAA明显降低，抑制物质类脱落酸ABA迅速上升，这与前人对草莓内源激素[10,15]应答低温相应研究结果一致；而8天后内源激素变化可能与草莓植株体内后期生理代谢调节物质控制密切相关。

低温贮藏不同时间引起草莓裸根苗的生理、内源激素发生变化，也会间接影响物候和产量。本研究结果表明低温贮藏不同程度地可以促进草莓花芽分化进程，缩短定植到盛花期的间隔时间，且低温处理小于8天始熟期可以提早，单株总产量差异不大，而低温处理大于14天始熟期推迟，总产量显著下降。如果同时定植不同冷藏时间的草莓种苗，是否得到相同结论有待进一步研究。笔者分析处理8天，定植时间是9月7日，外界自然温度适合草莓生长发育，利于花芽顺利分化；而低温贮藏14天，随着外界温度降低，定植时间的延后，草莓生长发育开始缓慢，期物候间隔拉长、成熟期推迟，同时期的产量也显著降低。

4 结论

笔者认为种苗体内生理指标和内源激素IAA、GA3、ABA相互协作，在低温胁迫过程中都起着重要的调控作用。虽然作用机理十分复杂，但都调节自身含量应对低温胁迫从而提高适应能力。本研究结果表明5℃低温可以安全贮藏草莓裸根苗。冷藏小于8天可以促进花芽分化，缩短物候之间时间，减少果实发育天数，4月之前单株总产量高于322.74 g，显著高于大于14天处理。建议生产上根据最佳定植时间，种苗低温贮藏运输时间控制在8天以内较为安全。