低温等离子体技术灭活细菌芽孢的研究进展

成军虎，张彦，韩忠

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（2.华南理工大学现代食品工程研究中心，广东广州 510006）

细菌芽孢的抗逆性强，在高低温、强酸强碱、高压、紫外线辐射等恶劣的环境下依然能够存活，比营养细胞更能抵抗外界不良环境因子。食物中残留的细菌芽孢萌发并大量繁殖之后，会造成食物腐败变质，甚至引发疾病，给食品安全带来很大的风险。

常见的引起食品腐败变质和食源性疾病的芽孢杆菌有蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）等。蜡样芽孢杆菌常残留于饭类、肉类及奶类食物中，能够产生呕吐毒素和多种肠毒素，引发呕吐和腹泻，在常温下储存含有蜡样芽孢杆菌的奶粉，一天之后能检测出呕吐毒素[1]。脂环酸芽孢杆菌极耐酸、耐热，能在pH 2.0～6.0和25～60 ℃的温度下生长繁殖[2]，常存在于水果和蔬菜表面，是引起果汁腐败变质的主要菌种，特别是巴氏消毒后的果汁[3]。

一般而言，细菌芽孢的形成是由外界营养物质的不足引起的，其过程复杂，主要经历的几个阶段如图1所示[4]。芽孢形成的第一个标志为不对称隔膜的出现，在细胞中央或一端，细胞膜内陷形成隔膜，产生小细胞。其后，小细胞被多层膜包裹逐步形成芽孢，在这个过程中，矿物质元素和多种化合物被运输进孢内，芽孢内的pH值维持在较低的水平以减少代谢活动，芽孢核内含水量处于30%～40%（营养细胞一般能达到70%～80%），此为芽孢的抗逆性提供了一定基础[5]。芽孢的这一特殊结构具有强稳定性，可以忍受极端环境，包括高温、辐射、化学抗性等，因此通常难以灭活，给食品加工领域带来挑战。细菌芽孢的灭活已成为当前研究的热点，而传统的灭菌方法如湿热杀菌、脉冲紫外线处理、辐射法等都存在不足之处，热加工会引起食物质地、风味和营养的变化，脉冲紫外线处理在光的穿透性、光子和微生物接触等方面有一定的限制性，而X、γ射线和电子束的杀菌方式则需要高成本的投入[6]。

低温等离子体技术是近几年发展起来的新型非热杀菌技术。等离子体是指部分或全部电离的气体，主要由自由电子、离子、紫外线（UV）光子以及由处于基态或激发态的原子组成的活性氧物质（Reactive oxygen species）、活性氮物质（Reactive nitrogen species），通常被称为物质的第四态。在食品领域，已有研究表明，通过激发气体放电产生等离子体，能够抑制食品中的酶，对食品中存在的微生物进行灭活[7,8]，并且对微生物芽孢的灭活有着明显的优势（表1）。目前，较为常见的气体放电方式为介质阻挡放电和电晕放电。Huang[9]等在空气介质阻挡放电6 min的条件下，实现了对淀粉芽孢杆菌芽孢的全部灭活。同时，低温等离子体也可与其他技术联合处理[10]，微波联合氦气等离子处理洋葱粉末中蜡样芽孢杆菌40 min，芽孢的数量减少2.10 log spores/cm2。

图1 芽孢形成过程示意图[4]Fig.1 The process of sporulation

由于低温等离子体技术具有不需要提供高的压强、消耗能量少、实验操作较为简单及设备支出费用相对较低，且在较温和的条件下，能够较大程度保持了食品的色泽、质构、营养成分，可以应用于水果、蔬菜、肉类、海鲜等食品的杀菌，在食品领域具有广阔的发展前景。

表1 不同等离子体对芽孢的灭活处理Table 1 Different plasma treatments on the inactivation of bacterial spores

1 低温等离子体技术

等离子体分为热等离子体和非热等离子体，非热等离子体中又包括平衡（100～150 ℃）和非平衡（＜60 ℃）等离子体。在非平衡体系中冷却离子和中性分子比通过转移电子的能量更有效，且气体能保持较低的温度。因此，非平衡等离子体也称为低温离子体，一般通过放电激发气体获得。

在放电过程中，高密度的电子通过气态介质在电场中被加速，使电子和气体中的原子及分子发生初次大量碰撞，这些碰撞会改变电子的方向和能量，但是由于质量差异，一些质量较大的粒子在碰撞过程中几乎没有动量传递，使得它们能保持接近外界环境的温度。当电子与原子或分子碰撞时，会发生一系列反应，反应的概率与电子的能量有关，包括[6]：

电离：e+M→M++2e，e+AB→A++B+2e

电子附着：e+M→M-，e+AB→A-+B

激发：e+M→M*+e

离解：e+AB→A+B

式中，M，A，B为原子；AB为分子。

对于在大气压下空气等离子，氧气和氮气经过电离、离解等反应生成基态或激发态的粒子如 O(3P)、O(1D)、N(4S)等，它们具有比单分子之间碰撞具有更低的活化能，与电子发生二次碰撞，进一步生成大量的活性氧、活性氮物质。同时，伴随着电子跃迁，会产生大量的紫外线，在紫外线和这些活性成分的作用下，对芽孢进行灭活。

2 低温等离子体对芽孢内外部结构的影响

芽孢具有极强的抗逆性，但其抵御外界极端条件的机制仍然没有很明确的说法。近年来的实验研究发现，可能的原因主要有以几点[18-21]：一是芽孢具有多层膜保护，芽孢衣、皮层、芽孢壁多层膜结构紧密复杂。二是芽孢形成时原生质体脱水和矿化导致内部含水量较低，产生吡啶二羧酸钙盐，内部pH在6.30～6.40范围内，可防止蛋白质解折叠，质子化和去质子化，从而稳定芽孢结构。三是芽孢内含有耐热小分子酶、酸溶蛋白等，耐热小分子酶在高温情况下仍具有一定活力抵御外界环境的影响，酸溶蛋白可以与双链DNA结合，从而起到保护DNA的作用，但不能与RNA或单链DNA结合。

通过低温等离子体处理，可以在一定程度上实现对芽孢外部膜结构、膜蛋白以及内部酶活性、DNA双螺旋分子的改变，从而灭活芽孢（图1）。目前已有文献表明[22-25]，低温等离子体对芽孢灭活的机理主要有：（1）等离子体中的活性氧、活性氮物质对芽孢衣蛋白和肽聚糖皮质层有刻蚀作用，增加膜的透过性；（2）激发气体所产生的紫外线（200～400 nm）对芽孢衣蛋白具有光子氧化作用，对芽孢内DNA分子双螺旋结构具有破坏作用；（3）活性氧、活性氮物质通过扩散进入芽孢内，对细胞质膜、细胞质中的蛋白以及DNA产生不可逆的改变。以上三种方式联合作用于芽孢，最终使芽孢破裂，实现对芽孢的灭活。

图2 低温等离子体灭活芽孢的机制Fig.2 The mechanisms of cold plasma on inactivation of bacterial spores

在低温等离子体处理下，对芽孢外部结构影响主要表现为芽孢形态的改变、等离子体中的活性氧、活性氮物质对芽孢外层膜的刻蚀作用以及膜组成成分的改变。使用四组气体（Ar，Ar+N2，Ar+O2，N2+O2）处理枯草芽孢杆菌，通过扫描电镜可以观察到芽孢长度逐渐减小[26]。Huang[9]等在大气压下使用空气介质阻挡放电对解淀粉芽孢杆菌进行1～5 min的处理，与对照组相比，电镜照片中所有的芽孢外层结构均发生改变（图3a），在干燥情况下处理3 min的芽孢外层膜都被等离子体产生的活性物质和紫外线光子蚀刻，并且可以观察到在表层有渗出物（图3d箭头所指），在干燥情况下处理5 min后的芽孢刻蚀程度更高，并且在皮层出现可见孔洞（图3e箭头所指）。而1 min湿润条件下处理，对芽孢外层膜的刻蚀程度比干燥情况下更严重（图3f），这也印证了后文中环境湿度的增加能提高芽孢灭活效率的结论。同时，通过对比处理前后的芽孢进行傅里叶变换衰减全反射红外光谱分析发现，芽孢膜中的蛋白质性质与空间结构均发生了显著变化，低温等离子体处理后出现主要的三个峰值在波数为1558 cm-1、1656 cm-1及1515 cm-1处，1558 cm-1的峰对应于酰胺I带中碳氧双键的延伸，1656 cm-1处的峰与酰胺 I带中蛋白质α螺旋结构改变有关，1515 cm-1峰值处的酪氨酸带向下移位，表明蛋白质有可能发生聚集[27,28]。同时，为探究芽孢膜蛋白对等离子体的敏感性，对四种芽孢杆菌突变体进行等离子体灭活处理，四种突变体的芽孢膜上分别缺失四种特定的蛋白，结果发现，四种芽孢的存活率依赖于缺失的特定蛋白[29]。且处理一定时间后芽孢能够几乎全部释放出细胞质中的吡啶二羧酸钙盐，分析可能与芽孢膜中脂质物质的改变有关[30,31]。

图3 低温等离子体对芽孢膜的刻蚀作用(Huang 2019)Fig.3 Etching effects of cold plasma on the spore membrane(This figure is adapted by Huang 2019)

对芽孢内部结构影响主要表现为细胞质中吡啶二羧酸钙盐的含量降低、芽孢内酶活性改变以及对芽孢内DNA的损伤。研究表明，在等离子体技术处理下，细胞内吡啶二羧酸钙盐的量随着芽孢暴露时间的增加而降低，大量吡啶二羧酸钙盐通过芽胞膜渗出，其中部分也可能已经被等离子体中的活性物质降解[14]。由于芽孢的抗逆性与其细胞内存有大量的吡啶二羧酸钙盐相关，其含量的减少能够大幅度提高灭活率[19,21]。对处理5 min的蜡样芽孢杆菌进行拉曼光谱分析[16]，细胞质中吡啶二羧酸钙盐的含量减少了21%。此外，Roth等人发现缺乏能够合成吡啶二羧酸钙盐基因的芽孢杆菌在等离子体的处理下更容易被灭活[8]。枯草芽孢杆菌内过氧化氢酶活性在等离子体处理下也发生了较大改变，处理30 s后，过氧化氢酶的活性随处理时间的增加呈线性减小，且在15 s后降到检测线以下[32]。芽孢内DNA携带着与芽孢内新陈代谢相关的信息，一旦相关的DNA受损，芽孢就很有可能死亡。研究表明，低温等离子体能造成芽孢内的DNA损伤，且主要与激发气体产生的紫外线有关，特别是激发氮气产生的活性氮物质时，常常伴随着较高强度紫外线的激发，产生对芽孢有害的光产物如胸腺嘧啶加合物[33]。紫外线根据波长可分为UV-C区（220～280 nm）、UV-B区（280～315 nm）和UV-A区（320～400 nm），不同波长的紫外线的产生受到多种因素的影响如激发气体类型以及等离子体发射源与处理样品之间的距离等，对DNA的损伤和芽孢灭活的贡献率也不尽相同，目前仍没有统一的结论。Hertwig[34]使用三组气体（Ar，Ar+0.14% O2，Ar+0.14% O2+0.20% N2）对枯草芽孢杆菌进行灭活，并对灭活过程中芽孢灭活率和DNA损伤进行动力学分析，发现不同气体条件下DNA损伤的动力学模型不同。使用不同截止波长的滤光器（SiO2，BG24A，MgF2，WG305等）对枯草芽孢杆菌在低温等离子下处理10 s[11]，提取芽孢内DNA进行PCR扩增。在用WG305滤光器（50%截止波长为280 nm）处理时，芽孢灭活效果最低，DNA呈现中等损伤。但也有研究表明，在发射源与样品之间的距离超过1.5 mm时，大气压下激发的UV-C区的紫外线会被空气所吸收，无法达到样品表面，对于芽孢衣蛋白的氧化作用及DNA损伤并不明显[35]，Wang[16]等处理的样品与等离子体发射源距离6 mm时，没有检测到UV-C区紫外线的现象。同时Pina[36]等的实验中，氮气激发的低温等离子体处理下，UV-A区紫外线所占据的比例更大，在337 nm，357 nm，380 nm波长处出现三个峰值。此外，芽孢衣含有与DNA修复有关的蛋白如α/β型酸可溶蛋白和DNA修复蛋白等，其与修复核酸切除机理相关，对突变体芽孢（缺乏α/β型酸可溶蛋白）进行低温等离子体处理的实验中发现，突变体对于在处理下的环境敏感性增加，在一定程度上间接表明低温等离子体会损伤芽孢内DNA，使芽孢灭活率降低[35]。但目前对芽孢内外结构特别是 DNA损伤机制的研究仍较少，还需更多的实验阐述其分子机理。

3 低温等离子体对芽孢类微生物灭活条件

表2 影响低温等离子体灭活芽孢的因素Table 2 Factors that affect the inactivation of bacterial spores by cold plasma

本部分主要阐述对芽孢类微生物的灭活中，在气体组成、装置功率、电压、环境湿度、接触样品和处理方式等条件不同对芽孢灭活程度的影响（表2）。

3.1 不同气体组成对芽孢类微生物灭活影响

被电离气体的组成成分和比例直接影响到等离子体活性氧、氮物质以及紫外线的产生。目前，常用于电离的气体有空气、氮气、氧气、二氧化碳、稀有气体等，其产生的活性氧物质如O2、O3、O（1D）等对芽孢衣、芽胞膜有蚀刻作用；活性氮物质如 N2、N+等能够通过激发紫外线产生光子造成芽孢内DNA的损伤[42]。

在用干燥空气，氮气，氧气和二氧化碳灭活萎缩芽孢杆菌实验中，用光学发射光谱法研究四种激发气体，发现氮气等离子体具有最高的发射强度，且产生紫外线的强度都高于其他三种气体，可以使芽孢减少5.10 log(cfu/mL)[14]。使用N2/O2混合的表面微波等离子体处理嗜热脂肪芽孢杆菌[17]，当气体混合比例为10% N2+90% O2时，氧原子密度达到最大，扫描电镜图下观察到芽孢膜蚀刻程度最高。在100% N2条件下，等离子体所激发的紫外线强度达到最大，但紫外线强度随着氧气比例的增加而减少。而当混合气体中氧气所占比例在30%-80%之间时，氧原子的蚀刻作用协同氮原子产生的紫外线对芽孢进行杀灭，此时灭活效率最高。

使用四组气体（Ar，Ar+N2，Ar+O2，N2+O2）处理枯草芽孢杆菌，通过扫描电镜可以观察到芽孢长度逐渐减小，且在N2+O2条件下，芽孢的长度减小得最快，速率可达到3.25 nm/s。处理240 s后，Ar，Ar+N2，Ar+O2三组气体对芽孢的灭活速率几乎相同，而N2+O2对芽孢的灭活速率是其他三组的两倍[26]。但Reineke[37]等使用三组气体（Ar，Ar+0.14% O2，Ar+0.14% O2+0.20% N2）对枯草芽孢杆菌进行灭活的实验中，对整个过程进行了三个阶段的检测，发现不同阶段气体灭活效率不同，而纯氩气总体的灭活效果最强。虽然发射光谱显示在 Ar+0.13% O2+0.20% N2条件下，激发的紫外线光子是纯氩气的四倍，但此时灭活效果次于纯氩气。通常来说，加氧的氦气会与电子发生碰撞，从而有助于提供更高水平的与氧有关的自由基与芽孢发生反应，并破坏芽孢的外部结构。但是，氧气的负电性可能使氦气与氧气的混合气体易于吸收等离子体中产生的电子，从而降低了电子能量和密度，削弱了对芽孢灭活的效率[43]。Hertwig[34]等使用同样三组气体测得结果也为氩气灭活芽孢效果最强。由此可见，芽孢灭活的程度与气体组成分和比例有着很大关系，在使用低温等离子体处理芽孢类微生物时，还需根据自身处理装置的条件和处理对象选择合适的气体进行实验。

3.2 装置功率和电压的不同对芽孢类微生物灭活影响

在一定条件下，随着低温等离子体发生装置功率和电压的升高，芽孢存活率越低[17,39-41,44]。这是因为激发气体所产生的等离子体浓度特别是活性氮物质的浓度，与装置的功率和电压呈正相关[36]。在一定范围内，所使用的功率或电压越大，在单位时间内电子的密度和能量越强，随之产生的等离子体浓度越高，对芽孢内外结构的改变将会更显著，从而达到灭活的效果。

Yang[17]等人发现，在灭活处理中，随着等离子体装置功率的增加，芽孢长度减小得越显著。使用微波等离子体激发纯氮气处理嗜热脂肪芽孢杆菌，在功率为400 W、600 W和800 W时，800 W功率实现了芽孢数量减少的最大值6 log(cfu/mL)，且在6 min，800 W的处理下，芽孢长度从1.80 µm减小到1.30 µm。在不同电压下（V=3.50、4.65、5.50、6.50 kV），使用大气压-氦气氧气混合等离子体处理枯草芽孢杆菌10 min，随着电压的升高，芽孢数量的减少量从 1.80 log(cfu/mL)增加到4 log(cfu/mL)[39]。在大气压下使用等离子体射流对黑胡椒中的枯草芽孢杆菌在30 kV下处理3 min和5 min，对枯草芽孢杆菌的灭活率都高于在相同时间内 15 kV的处理，可以达到 1.63 log(cfu/mL)[40]。此外，Kovalova[44]等研究表明，电压的类型也会对灭活效果产生影响，在用电晕放电处理蜡样芽孢杆菌时，脉冲电源比直流电源效果更好，但是由于需要考虑到能量的损耗，目前很难直接比较两种电源处理下对芽孢灭活率的影响，在这方面还需要更多的研究。

3.3 环境湿度、接触样品和处理方式的不同对芽孢类微生物灭活影响

在电离潮湿空气时，能产生更多的活性物质如氢氧自由基及NO、NOx等提高灭活效率，其中占主导因素的为氢氧自由基。对带有萎缩芽孢杆菌样品的密封包装充入干燥空气和相对湿度为3%、10%、30%、50%、70%的潮湿空气，进行介质阻挡放电灭菌，在潮湿空气下的灭菌效果明显高于干燥空气，相对湿度为3%可以使萎缩芽胞杆菌减少约5 log(cfu/mL)，相对湿度10%达到6 log(cfu/mL)，高于相对湿度10%可以使芽孢完全灭活[38]。

Los[13]等同样使用介质阻挡放电对亲水性和疏水性生物膜上的萎缩芽孢杆菌进行处理，发现亲水性的生物膜芽孢减少率最大，达到4.40 log(cfu/mL)。使用不同的样品接触表面对细菌芽孢的灭活作用效果也不同，用射频等离子体处理枯草芽孢杆菌，在玻璃皮氏培养皿中芽孢减少2.40～2.80 log(cfu/mL)，使用玻璃微珠减少3.90～4.60 log(cfu/mL)，而用胡椒子作为样品载体芽孢灭活率最高[34]。若是直接处理含有芽孢类微生物的食品，则灭活效果与样品的大小也有关。除了接触表面的性质以外，接触样品的空间结构大小同样会对灭活率产生影响。Kim[36]等对不同颗粒大小的红辣椒上的蜡样芽孢杆菌进行处理，颗粒小的样品有较大的三维空间，能够使激发的等离子体与辣椒颗粒接触更充分，处理后芽孢存活率较低，更适合应用于对微生物灭活。

处理方式在一定程度上也影响着等离子体处理后芽孢的存活率。激发气体产生的低温等离子体直接接触样品处理通常比间接接触效果好，使用三种不同气体（Air、90% N2+10% O2）直接或间接通过介质阻挡放电处理萎缩芽孢杆菌，使用空气间接处理薄膜包裹下的细菌芽孢样品30 s和60 s后，灭活效果较低且相差不大。而直接处理60 s芽孢存活率显著降低。同时，65% O2+30% CO2+5% N2直接接触处理60 s后获得最高灭活率，芽孢至少减少6 log(cfu/mL)[38]。此外，研究发现，加入其他物质与样品细菌协同处理能提高芽孢的灭活率。金属氧化物二氧化钛具有微生物灭活和分解化学物质的能力，将二氧化钛与带有芽孢的细菌混合，联合射频等离子体进行灭活处理，能产生更多的活性氧，灭活效果相比于射频等离子体单独处理D值减少40%[45]。通过光谱分析发现，主要是由于二氧化钛内部氧缺陷能级能量较低，二氧化钛颗粒更容易被活化，所以能产生更多的活性氧自由基，从而增大了对芽孢膜的破坏能力，提高了芽孢灭活率。

4 结束语

由于低温等离子体技术能在低温下实现对微生物的灭活，在食品领域的应用越来越普遍。在关于低温等离子体灭活芽孢类微生物的研究上，已报道的等离子体对芽孢灭活的内在机制，仍存在争议，尚未有清晰的结论，需要更多科研工作者的进一步研究证实，对于影响灭活效果的内外界因素的研究较为明确，但由于使用装置和处理条件的不同，很难设立最适合灭活的条件和标准，对于比较不同装置对芽孢类微生物灭活的差异还有待研究。另外，低温等离子体协同其他技术如微波处理，能够提高芽孢灭活率，或加入一些具有灭菌效果的物质如二氧化钛，与芽孢一起在等离子体条件下处理也能显著提高灭活率。此外，在现实情况中，芽孢的生长速率往往不同，不同发育阶段的芽孢（嫩芽孢、老芽孢）对于低温等离子体的处理可能也会有不同的效果，目前仍未有相关的研究情况，未来在针对低温等离子体处理不同发育阶段下细菌芽孢的研究将会有广阔的发展空间。